[发明专利]一种基于增强型绿色荧光蛋白基因缺失为筛选标记的克隆载体pGreen-S及其构建方法

说明书

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体的说是涉及一种基于增强型绿色荧光蛋白基因缺失为筛选标记的克隆载体pGreen-S及其构建方法。

背景技术

β-半乳糖苷酶基因(lacZ)是分子生物学中最为常用的报告基因，如pUC系列即是lacZ插入失活型载体。其筛选原理是：载体含有lacZ操纵子的DNA区段及编码β-半乳糖苷酶N端146氨基酸的基因片段(α肽段)，其编码区中同时形成多克隆位点，且不影响读码框和基因功能。化学物质异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)可诱导该片段的合成。选择α肽段缺陷型宿主菌(自身能合成C端的其余肽段)，在IPTG存在时，载体与宿主菌的β-半乳糖苷酶基因实现互补(α互补)，生成具有活性的β-半乳糖苷酶，使底物5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-硫代半乳糖苷(X-gal)分解成为蓝色化合物，表现为培养基上出现蓝色菌落。当外源DNA片段插入到质粒的多克隆位点时，使β-半乳糖苷酶N端片段的编码基因失活，不能形成α互补，则带有重组质粒的受体菌呈现白色菌落。人们可从菌落的颜色变化(蓝/白斑显色)来筛选重组体。

但是，实际应用中，这种方法存在的问题是，当插入的DNA片段(较小)不能破坏β-半乳糖苷酶的N端片段阅读框时，重组体菌落可表现出浅蓝色甚至蓝色，出现假阴性克隆，其误选率在30％左右。同时，蓝/白斑筛选方式有赖于诱导物IPTG及生色底物X-gal，以至使每个筛选平板增加1.5元左右的费用(以每平板加0.8mg IPTG与0.8mg X-gal计)。此外，筛选平板终止培养后需4℃静置过夜才能使颜色充分显现，因而延长了实验时间，降低了效率。

绿色荧光蛋白(green fluorescent protein，GFP)是从发光水母(AequoreaVictoria)分离的一种功能独特的天然荧光蛋白质。自1994年GFP克隆后，GFP及其突变体作为基因表达标记物或融合蛋白标记在动物、植物、微生物的研究中广泛应用。GFP荧光形成具有敏感、直观、即时的特点，且荧光的产生不需要加入任何外源底物、酶或其他辅助因子，因此GFP很适合作为基因重组体的筛选标记物。

已见报道的研究中[李寿东，齐义鹏，胡建红，林宏。生物工程学报，1997，13(3)：323-325；王进，李付广，李倩如，杜英。郑州大学学报医学版，2002，37(5)：621-624；董越梅，李久蒂，朱至清。植物学报，1999，41(5)：487-489]，基于GFP表达策略形成的载体存在明显不足：第一，外源基因插入位点均选择在GFP基因上游，其筛选策略是以插入基因是否导致GFP基因阅读框移码进而影响GFP的表达来筛选重组体，对插入基因序列要求严格，一旦不能满足要求则无法筛选重组体第二，改造后含GFP筛选标记的载体多克隆位点区域中，限制性内切酶位点较少，降低了基因重组的灵活性；因此，其实用性受到明显限制。

发明内容

本发明目的在于提供一种基于增强型绿色荧光蛋白(enhanced greenfluorescent protein，EGFP)基因缺失为筛选标记的克隆载体pGreen-S，使基因重组体的筛选结果更为简便可靠，筛选过程更为简便、经济、省时、高效。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

所述载体的主要构件是复制起始序列-EGFP基因上游多克隆位点-EGFP基因序列-EGFP基因下游多克隆位点-lacZ基因序列-抗性选择基因序列。

优选的方案是：所述的EGFP基因上游多克隆位点为EcoR I、Sac I、Kpn I、Sma I、Xma I、BamH I及Xba I酶切位点。

更为优选的方案是：所述的EGFP基因下游多克隆位点为Xba I、Sal I、PstI、Spn I及Hind III酶切位点。

更为优选的方案是：所述的抗性选择基因序列为Amp^r基因序列。

更为优选的方案是：一种宿主细胞，含有上述任一方案所述的克隆载体。

本发明的另一目的在于提供一种基于增强型绿色荧光蛋白基因缺失为筛选标记克隆载体pGreen-S的构建方法。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种基于增强型绿色荧光蛋白基因缺失为筛选标记的克隆载体pGreen-S的构建方法，包括如下步骤：

A)设计扩增引物，以质粒pEGFP-N1为模板进行PCR扩增EGFP基因；