[发明专利]增强含脂肪酶酵母细胞透性的方法

说明书

技术领域

本发明涉及酵母菌细胞的改性领域，具体涉及含脂肪酶酵母细胞的透性增 强方法，对胞内酶具有相当的保护作用，可保证胞内酶对于酯交换、酯合成和 酯水解反应催化作用的充分发挥，并延长酶的使用寿命。

背景技术

脂肪酶是一种良好的酯交换、酯合成和酯水解反应催化剂。以脂肪酶为催化 剂制备生物柴油，反应条件温和、醇用量少、甘油易回收、无废物，可以解决 目前化学法生产生物柴油所用催化剂存在的分离难、耗能多的问题。^[1][2]

以全细胞作生物催化剂，存在细胞壁和细胞膜对底物和反应产物的通透屏 障问题，即传质阻力问题。采用细胞透性化技术对细胞壁和膜的通透性处理， 可大大提高细胞酶活力。细胞透性化技术是指在不造成细胞裂解以及不破坏细 胞内部有机结构的情况下改变细胞壁和细胞膜的通透性，使得小分子物质和一 些较大分子物质能够自由地进出细胞的技术。细胞经过透性化处理后，整体结 构仍保持完整，对胞内酶仍具有相当的保护作用，可保证胞内酶催化作用的充 分发挥，并延长酶的使用寿命。通过细胞透性化技术增强细胞的通透性，减小 传质阻力，在不提取酶的情况下改善酶的作用效果，进而提高生物催化剂的经 济性和实用性。^[3][4]

参考文献：

[1]刘幽燕，庾乐，黄林峰，等.生物柴油制备方法的应用研究进展[J].现代化 工，2006，26(4)：15-20.

[2]Wei Du，Wei Li，Ting Sun，et al.Perspectives for biotechnological production of biodiesel and impacts[J].Appl Microbiol Biotechnol，2008，79：331-337.)

[3]周帅，王凤山.细胞透性化技术及其应用.技术与方法，2008，28(4)： 481-484.

[4]高惠玲，袁其朋，周延，等.用透性化细胞技术合成海藻糖.微生物学 通报，2004，31(3)：92-96.

发明内容

本发明的目的旨在增强含脂肪酶酵母细胞的透性，在不提取细胞内酶的情 况下，能够充分发挥细胞内酶活性，以期降低生物催化剂的制备成本。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：提供一种有机化合物来改善 含脂肪酶酵母细胞透性的方法，采用酮、卤代烃和芳香族化合物为细胞透性改 善剂，配制一定浓度的细胞透性改善剂与水的混合物，将培养成熟的产脂肪酶 酵母细胞浸泡于混合液中，再对浸泡的细胞进行收集、清洗并干燥处理，即得 透性改善的有催化活性的细胞。其方法包括如下步骤：

a、产脂肪酶酵母细胞的菌种活化：在葡萄糖(20g/L)、酵母粉(10g/L)、 蛋白胨(10g/L)和琼脂(20g/L)的斜面培养基上，于30℃静止培养72h；

b、产脂肪酶酵母细胞的液体种子培养：在葡萄糖(100g/L)、蛋白胨(5.3 g/L)、酵母粉(生化试剂北京奥博星生物技术有限公司)(2g/L)、尿素(2g/L) 和MgSO₄(0.5g/L)的液体培养基中，于30℃、160r/min摇床培养24h；

c.产脂肪酶酵母细胞的发酵液：在葡萄糖(100g/L)、蛋白胨(1.8g/L)， 酵母粉(0.5g/L)、KH₂PO₄(2g/L)且pH值自然的液体培养基中，于30℃、160 r/min摇床发酵72h；

d、产脂肪酶酵母细胞的收集：将发酵液过滤得成熟的湿酵母细胞，用生理 盐水洗涤湿细胞3次；

e、有机化合物的选取：选择酮、卤代烃和芳香族化合物中的一种为细胞透 性改善剂；

f、细胞浸泡：根据所选改善剂的特征，配制1.0～15％浓度的有机化合物与 水的混合物，将培养成熟的产脂肪酶酵母细胞浸泡于混合液中，在20～40℃浸 泡15～90min；

g、收集浸泡处理的细胞：过滤收集浸泡的细胞，再用去离子水清洗3次；

h、细胞干燥：于室温下自然风干24～48h。

其中，所述的酮为丙酮、丁酮或异戊酮；所述的卤代烃为二氯甲烷、三氯甲烷 或四氯化碳；所述的芳香族化合物为甲苯、乙苯或丙基苯。