[发明专利]人工活体冷冻提取组织超微结构及其蛋白分布标本的方法

说明书

技术领域：

本发明涉及医用组织结构检测标本提取的方法，特别是涉及一种应用“活体冷冻技术-IVCT”人工提取活体器官组织超微结构及蛋白分布标本的方法。

背景技术：

上世纪九十年代末，Ohno S等建立了“活体冷冻技术”(in vivocryotechnique-以下简称：IVCT)的理论和方法。即：在活体冷冻装置VI-11；Eiko Engineer Co.Ibaraki，Japan)上，采用异戊烷-丙烷混合冷冻剂，在-193℃下结合液态氮和冷冻置换等方法，瞬间捕获活体鼠肾脏超微组织结构标本的方法。采用此项技术提取的活体鼠肾脏内的所有生物进程被即刻停止，随后进行冷冻置换；此时结构组织中的水分子几乎同时冻结，形成无数个极小的冰晶(约20nm³)，达到无定形微晶态或玻璃态，不会对细胞和组织造成传统方法制取的损伤，能够原位保持其所有的结构与成分，并在含有固定液的无水有机溶液中使已冷冻的细胞和组织内的某些物质成分被快速交联，限制可溶性分子的弥散，原位保留了某些暴露的抗原位点。冷冻速度快(几毫秒～1秒)，能够捕捉细胞结构瞬间完成的生理过程，并以大于10⁴K/s的冷冻速率将生物组织固化至玻璃态或近似玻璃态，使生物组织的超微组织结构和各种组份得到可信的保存。一定厚度的组织(约20-30μm)用IVCT冷冻固定法在1ms左右的时间内能够被完全固定，其超微组织结构能得到极佳的保存。之后的冷冻置换可以从-80℃(以往置换环境是-25℃)，开始逐渐置换组织标本中的水分子，此时标本的生理活动基本上是处于停止状态，随着温度的上升，置换标本中水分子的速度加快，当标本的生理活动随着温度的上升开始恢复时，标本中水分已经减少许多；温度上升至-20℃时，低温置换的有机溶剂中所含的固定成分开始对标本进行二次固定和进一步脱水，直至标本温度上升至室温，固定和脱水过程完成。IVCT结合冷冻置换使标本生理活动被迅速固定的同时不会在后续的脱水过程中有所改变，制备的标本更符合其活体时的生理状态。

而传统的形态学人工采取的组织结构标本，是经过浸入的标本快速冷冻并结合临界点干燥法提取标本。如浸入固定或组织切割后快速冷冻，制取标本时均需将组织结构切割形成离体状态，其过程通常需要数十秒或数分钟，不可避免的造成活体的心脏停跳、血液循环停止的情况，形成人为的缺血、缺氧，很可能影响组织细胞结构形态、蛋白分布和分子构象，很难提取到快速改变细胞结构标本；提取标本后的固定，一般采用浸入常温或4℃固定剂中，或直接用固定剂灌流固定，一方面在上述温度下组织细胞的生理活动可能未完全停止，另一方面固定剂的交联也需要一定时间，而这期间可溶性成分可能发生改变，使组织和细胞变性，破坏他们的超微组织结构，都可能影响到真实反映活体状态下组织细胞组织结构的生理病理情况；继而的临界点干燥法中，在组织溶剂里、室温条件下，采取的快速干燥过程，也常导致标本组织结构皱缩和渗透性发生改变，临界点干燥法也会不可避免的伴有人为操作等问题。因此，传统标本制备方法易引起细胞基质丢失和超微组织结构改变。

另外，采用化学固定提取标本的方法，是通过化学固定剂与标本中的蛋白质等成份交联成稳定的凝胶，使标本中的一些组份和结构固定下来。化学固定剂如戊二醛、多聚甲醛、锇酸等，与细胞和组织内分子的交联作用需要一定的时间，这期间可溶性成分可能发生改变，组织和细胞可能变性，会引起超微组织结构发生变异，从而不能真实反映活体状态下自身的生理病理状况，进而对正确分析细胞组织结构等带来一定的困难。

综上所述，与化学和传统提取标本的方法相比较，IVCT在保持活体器官正常生存、血液循环存在的条件下，即刻冷冻标本保存了具有功能意义的细胞、组织及其内在所有生物学成分的原貌形态学和功能状态。相比之下，IVCT可减少从提取标本、固定到脱水过程中产生的形态学改变，极大程度保存了真实的超微组织结构，减少了人为因素造成的影响。

采用的先进提取活体组织结构标本的方法，结合当前应用的很多检测技术如HE染色、免疫染色、免疫组化染色，以及荧光探针等，通过各种光学显微镜、共聚焦显微镜和电子显微镜技术，显示了活体内生物成分的原始结构和细胞内定位、功能细胞的原始形态学，已成为检验活体器官原始功能形态结构及对高度时间分辨率和时间依赖的细胞和组织结构内动态的生物成分进行分析的良好方法。