[发明专利]海参肠道组织蛋白酶B的分离纯化方法

说明书

技术领域

本发明属于从海洋动物提取蛋白酶，同时涉及采用离子交换层析技术、凝胶层析技术、高效液相色谱技术、冷冻干燥的技术等领域。

背景技术

溶酶体中存在多种组织蛋白酶，目前已从鱼贝类肌肉和内脏中纯化并鉴定10种组织蛋白酶，即组织蛋白酶A、B、C、D、E、H、L、L-like、X及S。

对组织蛋白酶B的研究主要集中在鱼类。目前，已从gray mullet、tilapiamossambica、鲭鱼、common Mackerel、chun salmon、鲤鱼肌肉中纯化了组织蛋白酶B，并对其进行了鉴定。

组织蛋白酶B(Cathepsin B，CB)是一种溶酶体半胱氨酸蛋白水解酶，具有内肽酶活及羧肽酶活，对肌肉蛋白质有广泛的降解作用。研究表明，在pH 5.0时，CB能够水解肌球蛋白、肌钙蛋白、原肌球蛋白和肌动蛋白。CB的催化作用由Cys，His实现，易被巯基试剂抑制，又称巯基酶，属于木瓜蛋白酶家族。近年来研究发现，组织蛋白酶也参与细胞凋亡过程，其中组织蛋白酶B、C等能直接或间接地激活Caspase(天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶)而触发细胞凋亡，从而加速组织自溶。

目前，尚未有海参肠道组织蛋白酶B的相关提取方法，也未见到相关的文献合信息报道。

发明内容

针对海参贮存十分困难，因为其体内存在的酶类的协同催化作用可将自身体内的蛋白质水解，引发海参神奇的自溶现象。本发明旨在研究海参自溶相关的组织蛋白酶B，对海参自溶酶系的研究，将有助于延长海参贮存期、优化加工条件及其开发出更有营养价值的功能性食品。

本发明的技术方案是：在低温条件下，对海参肠匀浆破碎，缓冲液浸提，采用硫酸铵分级沉淀提取组织蛋白酶B粗酶。并依次利用离子交换树脂、凝胶层析技术使粗酶达到纯化。

具体操作步骤为：

1.海参的处理

取新鲜活海参，去体壁后将海参肠清洗，去除泥沙和杂质。

2.粗酶的提取

将其用1～20倍海参肠体积的0℃的含5～200mmol/L L-Cys(L-半胱氨酸)的5～200mmol/L pH 3.0～6.8的醋酸钠缓冲液匀浆破碎；在4℃下浸提4～18h，采用6000～20000×g(4℃)冷冻离心5～60min，取上层清液。选择硫酸铵饱和度为10％～90％，对所得上层清液进行硫酸铵分级沉淀，经6000～20000×g(4℃)冷冻离心20～60min后，取沉淀，并用上述醋酸钠缓冲液溶解沉淀，透析除盐后浓缩，即得到组织蛋白酶B粗酶。

所述硫酸铵分级沉淀目的是在不同的硫酸铵饱和度下使不同的蛋白质从溶液中沉淀析出，选择目的蛋白的最大饱和度作为硫酸铵的最终饱和度。本实验选用5～200mmol/L pH 3.0～6.8的醋酸钠缓冲液作为提取海参肠组织蛋白酶B的浸提液。具体操作如下：取新鲜海参肠用上述浸提液浸提，匀浆捣碎后经冷冻离心5～60min后，取上清液，平均分成6份后并在4℃和磁力搅拌下依次向上清液中加入研磨后的硫酸铵，使其饱和度分别达到0％、20％、40％、60％、80％、90％，静置4h后，冷冻离心20～60min，取上清液测定酶活力。选取酶活力最大所在的硫酸铵饱和度作为分级沉淀的条件。

3.组织蛋白酶的纯化

将得到的组织蛋白酶B粗酶用离子交换层析色谱、凝胶色谱、高效液相色谱中的2～3种方法达到纯化的目的，其中离子交换层析色谱是必须使用的。凝胶色谱可以用一种或两种不同的层析方法先后进行纯化。

(1)离子交换色谱采用DEAE Sepharose CL-6B，采用含0.01～10mmol/L的NaCl的5～200mmol/L L-Cys的pH5.0～6.5的磷酸钠缓冲液线性洗脱，流速为0.5ml/min，将有酶活力的部分收集，透析除盐后浓缩。

(2)凝胶色谱采用G-75或/和Sephacryl 100HR方法：

G-75凝胶层析：采用含0.01～10mmol/L的NaCl的5～200mmol/L L-Cys的pH5.0～6.5的磷酸钠缓冲液洗脱，流速为0.5ml/min，将有酶活力的部分收集，透析除盐后浓缩。

Sephacryl 100HR凝胶层析：采用含0.01～10mmol/L的NaCl的5～200mmol/L L-Cys的pH5.0～6.5的磷酸钠缓冲液洗脱，流速为0.5ml/min，将有酶活力的部分收集，透析除盐后浓缩。