[发明专利]海参肠道组织蛋白酶B的分离纯化方法

权利要求书

1.海参肠道组织蛋白酶B的分离纯化方法，其特征在于操作步骤为：

(1)海参处理：

取新鲜活海参，去体壁后将海参肠清洗，去除泥沙和杂质；

(2)粗酶提取：

将其用1～20倍海参肠体积的0℃的含5～200mmol/L L-Cys(L-半胱氨酸)的5～200mmol/L pH 3.0～6.8的醋酸钠缓冲液匀浆破碎；在4℃下浸提4～18h，6000～20000×g冷冻离心5～60min，取上层清液用选择好的硫酸铵饱和度进行硫酸铵分级沉淀，后4℃下经6000～20000×g冷冻离心20～60min，取沉淀，并用上述醋酸钠缓冲液溶解沉淀，透析除盐后浓缩，即得到组织蛋白酶B粗酶；

所述用选择好的硫酸铵饱和度进行硫酸铵分级沉淀中选择好的硫酸铵饱和度是按如下步骤得到的：取新鲜海参肠用5～200mmol/L、pH 3.0～6.8的醋酸钠缓冲液浸提，匀浆捣碎后经冷冻离心5～60min，取上清液，平均分成6份后并在4℃和磁力搅拌下依次向上清液中加入研磨后的硫酸铵，使其饱和度分别达到0％、20％、40％、60％、80％、90％，静置4h后，冷冻离心20～60min，取上清液测定酶活力，选取酶活力最大所在的硫酸铵饱和度作为分级沉淀的条件；

(3)酶的纯化：

将得到的组织蛋白酶B粗酶用离子交换层析色谱、凝胶色谱和高效液相色谱中的2～3种方法达到纯化的目的，其中离子交换层析色谱是必须使用的。

2.根据权利要求1所述海参肠道组织蛋白酶B的分离纯化方法，其特征在于步骤(3)酶的纯化：将得到的组织蛋白酶B粗酶用离子交换层析色谱、凝胶色谱和高效液相色谱中的2～3种方法达到纯化的目的中所述组织蛋白酶B粗酶用离子交换层析色谱进行纯化的具体步骤为：采用DEAE Sepharose CL-6B离子交换层析色谱柱，以含0.01～10mmol/L的NaCl的5～200mmol/L L-Cys的pH5.0～6.5的磷酸钠缓冲液线性洗脱，流速为0.5ml/min，将有酶活力的部分收集，透析除盐后浓缩。

3.根据权利要求1所述海参肠道组织蛋白酶B的分离纯化方法，其特征在于步骤(3)酶的纯化：将得到的组织蛋白酶B粗酶用离子交换层析色谱、凝胶色谱和高效液相色谱中的2～3种方法达到纯化的目的中所述组织蛋白酶B粗酶用凝胶色谱进行纯化，是采用G-75凝胶层析柱或/和Sephacryl 100HR凝胶层析柱进行纯化，具体步骤为：采用含0.01～10mmol/L的NaCl的5～200mmol/LL-Cys的pH5.0～6.5的磷酸钠缓冲液洗脱，流速为0.5ml/min，将有酶活力的部分收集，透析除盐后浓缩。

4.根据权利要求1所述海参肠道组织蛋白酶B的分离纯化方法，其特征在于步骤(3)酶的纯化：将得到的组织蛋白酶B粗酶用离子交换层析色谱、凝胶色谱和高效液相色谱中的2～3种方法达到纯化的目的中所述组织蛋白酶B粗酶用高效液相色谱技术进行纯化是采用TSK-3000 SWxl凝胶色谱柱，用0.01～10mmol/L的Na₂SO₄洗脱，流速为0.1～0.5ml/min，将有酶活力的部分收集，透析除盐后浓缩。

5.根据权利要求1～4中任一项所述海参肠道组织蛋白酶B的分离纯化方法，其特征在于所述的浓缩采用以下三种方法之一进行：

(1)超滤浓缩法：

选择1000～10000分子量的超滤膜，将小分子蛋白和金属离子去除，达到浓缩的目的；

(2)聚乙二醇浓缩法：

将所需浓缩的酶液装于分子量为10000的透析袋内后，置于4℃条件下的烧杯中，向其中添加聚乙二醇，直到透析袋被覆盖，当透析袋内溶剂渗出即被聚乙二醇迅速吸去，从而达到浓缩的目的；

(3)采用冷冻干燥技术：

将得到的粗酶冷冻干燥得到干粉，将干粉复溶于1～2ml浸提液中，形成溶液，以达到浓缩的目的。