[发明专利]水产品中9种致病性微生物检测试剂盒及检测方法

权利要求书

1.水产品中9种致病性微生物检测试剂盒，其特征在于包括浓度为5U/μL 的Taq DNA聚合酶和PCR反应液；其中的PCR反应液中含10mM Tris·HCl、 50mM KCl、25mM MgCl₂、dNTP各2.5mM及9种致病性微生物的引物对， 所述的引物序列及其浓度如下：

试剂盒保存条件：-20℃保存。

2.水产品中9种致病性微生物的检测方法，其特征在于使用权利要求1所 述的试剂盒，包括如下步骤：

①取2μl待测样品DNA溶液，加入10μl试剂盒中的PCR反应液、0.2μL Taq DNA聚合酶及灭菌超纯水7.8μL，总体积20μL；5000r/min离心10s，然后 按下列参数进行PCR扩增：

预变性：94℃，3min；

进入循环：94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸60s，35个循环；

终止延伸：72℃，7min；

PCR产物4℃保存；

②将PCR产物进行DHPLC分析，DHPLC分析条件如下：

色谱柱：PS-DVB&C18DNASep色谱柱，4.6mm×50mm，粒度3μm；

柱温：50℃；

按照体积比，流动相的组成为：

0.0min，55.0％缓冲溶液A，45.0％缓冲溶液B，

3.5min，50.2％缓冲溶液A，49.8％缓冲溶液B，

6.2min，41.8％缓冲溶液A，58.2％缓冲溶液B，

8.4min，38.2％缓冲溶液A，61.8％缓冲溶液B，

10.4min，36.3％缓冲溶液A，63.7％缓冲溶液B，

12.4min，35.0％缓冲溶液A，65.0％缓冲溶液B，

其中，缓冲溶液A为50ml TEAA和250μl乙腈混合，加灭菌超纯水定容至 1000ml所得溶液；缓冲溶液B为50ml TEAA和250ml乙腈混合，加灭菌超纯水 定容至1000ml所得溶液；

流速：0.9mL/min；

检测器：荧光检测器，光源：150W Xenon灯；激发谱带宽：15nm；发 射谱带宽：15.3nm；检测灵敏度：在波长350nm积分2s；

上样量：PCR产物10μL。