[发明专利]水产品中9种致病性微生物检测试剂盒及检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及食品中病原微生物的检测方法，尤其涉及利用多重PCR及变性 高效液相色谱(DHPLC)技术检测水产品中多种致病性微生物的方法。还涉及 检测所使用的组合物，即试剂盒。

背景技术

随着生活水平的提高以及我国加入WTO后市场逐步开放，人们对水产品 的需求不断增大，同时水产品的进出口贸易也在扩大。水产品中可能存在多种 能够引起人类肠道疾病的细菌，弧菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、肠出血性 大肠杆菌O157:H7、单增李斯特菌等都是水产品中常见的致病菌菌。种类多、 数量少、难于富集和体外培养是食源性致病菌的特点，也决定它们一直是微生 物检测中的难点和空白点。现有的检测技术如微生物培养和生化鉴定、免疫学 技术、PCR技术等均存在一些问题：常规的生化鉴定方法操作复杂，耗时长， 往往一次检测实验只能鉴定一种或少数几种细菌；免疫学技术虽灵敏性高，但 易污染，经常出现假阳性现象；PCR技术一般要与凝胶电泳技术联用，而电泳 结果不能作为最终结论，还需要进行其他探针杂交实验。目前对食源性微生物 的检测还主要依靠传统的增菌、分离、生化鉴定方法。这类方法普遍费时费力、 检测周期长、灵敏度低。比如沙门氏菌传统检测方法要用12种培养基，20多个 大小步骤，操作比较复杂，工作量很大，从取样到出检验报告耗时至少6～8个 工作日。而对于一些生化特性复杂的细菌，如单增李斯特氏菌，由于其对培养 条件要求高，生长缓慢，检测和鉴定周期长，并且传统培养生化检测方法检出 率不高，最长的检测周期可达20天之久。此外，长期以来由于弧菌属细菌的生 化特征不稳定，食品中的弧菌检测也是食源性微生物检测的一大难点。目前对 食品中常见致病性弧菌的检测，主要应用生化反应进行鉴定。丁茂文等在研究 中发现，API 20E和20NE生化鉴定方法对副溶血弧菌、拟态弧菌、非O1群霍 乱弧菌等某些细菌的鉴定易产生错误结果。PCR-凝胶电泳检测方法虽然检测成 本低，但反应产物电泳处理极易造成污染；特异性强，灵敏度高的实时荧光PCR 方法，存在检测成本较高，荧光探针保存时间较短等问题。

食源性微生物检测所面临的另一个问题是高通量检测的问题。由于水产品 中往往存在多种致病菌。因此同时检测多种致病菌的技术也急需发展。上文中 述及的微生物检测方法均难以实现此目的。目前国内外关于食品中微生物高通 量检测技术，有RiboPrinter全自动细菌鉴别系统(BAX系统)和基因芯片检测 技术。前者及其所使用的试剂和耗材均极其昂贵，不易推广应用；后者需要特 殊实验室条件来完成，并且检测结果受多种因素影响，重复性和稳定性较差。 变性高效液相色谱(DHPLC)采用离子对反相高效液相色谱的原理，是通过使 用特殊的耐高温液相色谱分离柱同时采用温度调控的方式，对核苷酸片段分子 进行分析分离的方法。该技术的发明为生命科学领域里的核酸分析提供了方便 实用的技术平台。其快速高通量、全自动化操作、准确度高、重复性好及敏感 性高的优点使其在核酸分析中具有无可替代的优势。该技术在已知和未知基因 突变的检测和筛选、基因分型、基因定量和长度多态性分析等领域已经得到广 泛应用。

本发明即旨在利用mPCR和DHPCL技术，建立可快速、灵敏、高通亮检 测水产品中9种常见的病源性微生物的快速检测技术。

发明内容

本发明的目的在于提供一种用于灵敏快速检测水产品中9种常见的病源性 微生物，即霍乱弧菌、副溶血性弧菌、创伤弧菌、溶藻弧菌、拟态弧菌、肠出 血性大肠埃希氏菌O157:H7、沙门氏菌、单核细胞增生李斯特氏菌和金黄色葡 萄球菌的mPCR-DHPLC检测试剂盒。

本发明所述的试剂盒包括浓度为5U/μL的Taq DNA聚合酶和PCR反应液； 其中的PCR反应液中含10mM Tris·HCl、50mM KCl、25mM MgCl₂、dNTP (dATP、dGTP、dCTP和dTTP)各2.5mM及9种致病性微生物的引物对，所 述的引物序列及其浓度如下：

试剂盒保存条件：-20℃保存。

本发明还提供了利用上述试剂盒检测上述这9种致病性微生物的方法，包 括如下步骤：

①取2μl待测样品DNA溶液，加入10μl试剂盒中的PCR反应液、0.2μL Taq DNA聚合酶及灭菌超纯水7.8μL，总体积20μL；5000r/min离心10s，然 后按下列参数进行多重PCR扩增：

预变性：94℃，3min；