[发明专利]肉制品中布氏菌检测试剂盒及检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及肉制品中布鲁氏菌属及分种检测鉴定方法，包括羊布鲁氏菌，牛布鲁氏菌，猪布鲁氏菌，绵羊布鲁氏菌，狗布鲁氏菌，森林鼠布鲁氏菌6种布鲁氏菌的同时检测方法，尤其涉及利用PCR-DHPLC对肉制品中6种布鲁氏菌进行检测和分型的方法。还涉及检测所使用的组合物，即试剂盒。 

背景技术

现有的检测技术如细菌培养和生化鉴定、免疫学技术、PCR技术等均存在一些问题：常规的生化鉴定方法操作复杂，耗时长，往往一次检测实验只能鉴定一种或少数几种细菌；免疫学技术虽灵敏性高，但易污染，经常出现假阳性现象；PCR技术一般要与凝胶电泳技术联用，而电泳结果不能作为最终结论，还需要进行其他探针杂交实验。PCR-凝胶电泳检测方法虽然检测成本低，但反应产物电泳处理极易造成污染；特异性强，灵敏度高的实时荧光PCR方法，存在检测成本较高，荧光探针保存时间较短等问题。因此，上述检测方法不能满足同时快速检测多种细菌的需要。对于布鲁氏菌的鉴别急需一种稳定快速的方法。 

目前国内外对于布鲁氏菌的检测则更为落后，还主要依靠传统的增菌、分离、生化鉴定方法。培养鉴定和血清学检查是进行布鲁氏菌检验的重要方法。布鲁氏菌属分成六种，包括羊布鲁氏菌，牛布鲁氏菌，猪布鲁氏菌，绵羊布鲁氏菌，狗布鲁氏菌，森林鼠布鲁氏菌。布鲁氏菌对培养条件要求较高，生长缓慢，检测和鉴定周期长，而且传统培养生化检测方法检出率不高。布鲁氏菌属细菌营养要求较高，传统平板培养生长缓慢，初次分离需经5天到10天，甚至2周以上。用血清学反应鉴定布氏菌存在很多交叉反应，与布氏菌有共同抗原呈血清交叉反应的微生物近30种，其中最重要的是小肠结肠炎O:9型。而且布鲁氏菌分离鉴定过程中易造成实验室污染，是易发生实验室传染的烈性传染病的病原菌。因此建立快速检测和鉴定布鲁氏菌的检验方法势在必行。 

本发明运用通用引物PCR结合DHPLC技术进行布鲁氏菌属和6种布鲁氏 菌的同时检测。应用本发明的试剂盒，6种布鲁氏菌可以用一对引物就检测出来；在本发明的非变性DHPLC分析条件下，通用引物从样品中检测出布鲁氏菌属；在本发明的部分变性DHPLC分析条件下，进行布鲁氏菌的分种检测，分别检测出6种布鲁氏菌的类别。通用引物PCR反应克服了单一PCR反应中操作比较繁琐，交叉污染机会较多等缺点，可以在一个反应体系中同时扩增多个目的基因，操作简便快速。在一次操作过程中同时检测布鲁氏菌属各种布鲁氏菌，使得布鲁氏菌的检测时间、检测数量和检测水平上都发生了很大的飞跃。与一些传统的布鲁氏菌检测及鉴定方法如生化水平鉴定、免疫学技术、PCR技术的鉴定相比，极大的缩短了操作的时间，而且大大降低假阳性和假阴性结果的出现，使得结果更加准确、可靠。 

发明内容

本发明的目的在于提供一种用于灵敏快速检测肉制品中布氏菌，包括羊布鲁氏菌，牛布鲁氏菌，猪布鲁氏菌，绵羊布鲁氏菌，狗布鲁氏菌和森林鼠布鲁氏菌6种布鲁氏菌的mPCR-DHPLC检测试剂盒。 

本发明所述的试剂盒包括浓度为5U/μL的Taq DNA聚合酶和PCR反应液；该PCR反应液中含10mM Tris·HCl、50mM KCl、25mM MgCl₂、dNTP(dATP、dGTP、dCTP和dTTP)各2.5mM及布鲁氏菌属通用检测引物0.2mM，所述的引物对序列为： 

上游引物：5’-TGGCTCGGTTGCCAATATTCAA-3’ 

下游引物：5’-CGCGCTTGCCTTTCAGGTCTG-3’ 

试剂盒保存条件：-20℃保存。 

本发明还提供了利用上述试剂盒检测上述这6种布氏菌并对其进行分种的方法，包括如下步骤： 

①取1ul待测样品DNA溶液，加入10ul试剂盒中的PCR缓冲液和0.25μLTaq DNA聚合酶，灭菌超纯水38.75μL，总体积50μL；5000r/min离心10s，然后按下列参数进行PCR扩增： 

预变性：93℃，5min； 

进入循环：93℃变性60s，60℃退火60s，72℃延伸60s，40个循环； 

终止延伸：72℃，10min； 

4℃保存反应产物； 

②非变性条件下分析PCR产物，以检测布鲁氏菌属微生物，DHPLC检测条件如下： 

色谱柱：PS-DVB & C18 DNASep色谱柱，4.6mm×50mm，粒度3μm； 

柱温：50℃；