[发明专利]肉制品中布氏菌检测试剂盒及检测方法

权利要求书

1.肉制品中布氏菌的检测方法，其特征在于包括如下步骤：

①取1ul待测样品DNA溶液，加入10ul PCR反应液和0.25μL浓度为5 U/μL的Taq DNA聚合酶，灭菌超纯水38.75μL，总体积50μL；5000r/min离 心10s，然后按下列参数进行PCR扩增：

预变性：93℃，5min；

进入循环：93℃变性60s，60℃退火60s，72℃延伸60s，40个循环；

终止延伸：72℃，10min；

4℃保存反应产物；

步骤①中所述的PCR反应液中含10mM Tris·HCl、50mM KCl、25mM MgCl2、dNTP各2.5mM及布鲁氏菌属通用检测引物0.2mM，所述的引物对 序列为：

上游引物SEQ ID NO.1：5’-TGGCTCGGTTGCCAATATTCAA-3’

下游引物SEQ ID NO.2：5’-CGCGCTTGCCTTTCAGGTCTG-3’；

②非变性条件下分析PCR产物，以检测布鲁氏菌属微生物，DHPLC检 测条件如下：

色谱柱：PS-DVB＆C18 DNASep色谱柱，4.6mm×50mm，粒度3μm；

柱温：50℃；

流动相，按体积比计：0.0min，55.0％缓冲溶液A，45.0％缓冲溶液B，

                    0.5min，50.2％缓冲溶液A，49.8％缓冲溶液B，

                    2.4min，44.2％缓冲溶液A，55.8％缓冲溶液B，

                    4.3min，40.9％缓冲溶液A，59.1％缓冲溶液B，

                    6.1min，38.8％缓冲溶液A，61.2％缓冲溶液B，

                    8.0min，37.3％缓冲溶液A，62.7％缓冲溶液B，

其中，缓冲溶液A为50ml TEAA和250μl乙腈混合，加灭菌超纯水定容至 1000ml所得溶液；缓冲溶液B为50ml TEAA和250ml乙腈混合，加灭菌超纯水 定容至1000ml所得溶液；

流速：0.9mL/min；

检测器：荧光检测器，光源：150W Xenon灯；激发谱带宽：15nm；发 射谱带宽：15.3nm；检测灵敏度：在波长350nm积分2s；

上样量：PCR产物5μL；

③部分变性条件下分析PCR产物，以进行6种布氏菌的分种检测， DHPLC检测条件为：

色谱柱：PS-DVB&C18 DNASep色谱柱，4.6mm×50mm，粒度3μm；

柱温：60℃；

流动相，按体积比计：0.0min，50.3％缓冲溶液A，49.7％缓冲溶液B，

                    0.5min，45.3％缓冲溶液A，54.7％缓冲溶液B，

                    5.0min，36.3％缓冲溶液A，63.7％缓冲溶液B，

其中，缓冲溶液A为50ml TEAA和250μl乙腈混合，加灭菌超纯水定容至 1000ml所得溶液；缓冲溶液B为50ml TEAA和250ml乙腈混合，加灭菌超纯水 定容至1000ml所得溶液；

流速：0.9mL/min；

检测器：荧光检测器，光源：150W Xenon灯；激发谱带宽：15nm；发 射谱带宽：15.3nm；检测灵敏度：在波长350nm积分2s；

上样量：PCR产物5μL。