[发明专利]食品中金黄色葡萄球菌毒素基因的检测试剂盒及检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及用于食品中金黄色葡萄球菌毒素基因的检测试剂盒及检测方法，尤其涉及基于PCR-DHPLC的快速检测试剂盒和检测方法。

背景技术

金黄色葡萄球菌在不同食物、不同温度和pH值的条件下，产生的肠毒素是不同的。金黄色葡萄球菌肠毒素(SE)有12个血清型，分别为剥脱毒素ETA(exfoliative toxin A)、SEB、SEC、SEE、SEI、SEA、SEJ、ETB、中毒休克毒素TSST(toxic shock syndrome toxin)、SED、SEH、SEG。

金黄色葡萄球菌在pH值低于5的条件下很少产生肠毒素，当pH值高于9.8时，无论何型葡萄球菌肠毒素都不能产生。葡萄球菌在牛奶和谷粉粥上，于20℃～37℃下经4h～8h产生毒素，在5℃～6℃低温下18d产生毒素或不产生毒素。在含水分、蛋白质和淀粉较多的食品中，葡萄球菌较易繁殖并产生毒素，如带菌的生肉馅，于37℃下经18h～19h产生毒素，若在肉馅中加入少量馒头碎屑，在同样温度下只经过8h就能产生毒素，可见淀粉对形成毒素有促进作用。

引起金黄色葡萄球菌肠毒素中毒的食品：主要为肉、奶、鱼、蛋类及其制品等动物性食品。糕、凉拌切粉、剩大米饭和米酒等也曾引起过中毒；熟肉类如在熟后污染了致病葡萄球菌，又在20℃～30℃的环境下放置较长时间，则极易引起中毒；奶和奶制品以及用奶制作的冷饮(冰激凌、冰棍)和奶油糕点常是引起中毒的食品；油煎鸡蛋、熏鱼、油浸鱼罐头等含油脂较多的食品，在污染上致病性葡萄球菌以后也能产生毒素。金黄色葡萄球菌在空气中氧分低时较易产生肠毒素，因此带有此菌的食品，在通风不良的高温下放置，极有利此菌生长并产生毒素。当食品污染了葡萄球菌并同时污染了其他微生物时，葡萄球菌的繁殖则受到抑制。如食品经加热，原有的各种微生物已被杀死，拮抗微生物也不复存在，熟后再一次被葡萄球菌污染，则将会促进葡萄球菌的生长并形成毒素。金黄色葡萄球菌引起的食物中毒在世界各地均有发现。常发生于夏秋季节，这是因为气温较高，有利于细菌繁殖。但在冬季，如受到污染的食品在温度较高的室内保存，葡萄球菌也可繁殖并产生毒素。当此细菌数＞10⁶个/克时，产生的肠毒素可引起食物中毒等病症。

因此，建立对金黄色葡萄球菌12种毒素基因，即ETA、SEB、SEC、SEE、SEI、SEA、SEJ、ETB、TSST、SED、SEH和SEG的快速、准确、高灵敏的检测方法就尤为必要。

发明内容

本发明首先提供用于检测金黄色葡萄球菌12种毒素基因，即ETA、SEB、SEC、SEE、SEI、SEA、SEJ、ETB、TSST、SED、SEH和SEG的试剂盒。

本发明所述的食品中金黄色葡萄球菌毒素基因的检测试剂盒中包括检测溶液A和检测溶液B：

检测溶液A中含10mM Tris·Cl、50mM KCl、25mM MgCl₂、dNTP各2.5mM、Taq DNA聚合酶5U/μL及ETA、SEB、SEC、SEE、SEI和SEA六种毒素基因引物对各10μM；这6种毒素基因的特异性引物序列如下：

检测溶液B中含10mM Tris·Cl、50mM KCl、25mM MgCl₂、dNTP各2.5mM、Taq DNA聚合酶5U/μL及SEJ、ETB、TSST、SED、SEH和SEG六种毒素基因引物对各10μM；检测溶液B中这6种毒素基因的特异性引物序列如下：

本发明还提供了利用上述试剂盒检测食品中金黄色葡萄球菌毒素基因的方法，包括如下步骤：

①PCR反应：取1ul待测样品DNA溶液，加入10ul试剂盒中的检测溶液A和14ul灭菌超纯水，总体积25ul；另取1ul待测样品DNA溶液，加入10ul试剂盒中的检测溶液B和14ul灭菌超纯水，总体积25ul；两个反应体积分别在5000r/min离心10s，然后按下列参数进行PCR扩增：

预变性：94℃，3min；

进入循环：94℃变性60s，60℃退火60s，72℃延伸60s，35次循环；

终止延伸：72℃，7min；

②将PCR扩增产物进行DHPLC分析：

色谱柱：PS-DVB&C18DNASep色谱柱，4.6mm×50mm，粒度3μm；

柱温：50℃；

流动相(体积比)：0.0min，55.0％缓冲溶液A，45.0％缓冲溶液B；