[发明专利]食品中常见弯曲菌检测试剂盒及其检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及病原微生物的检测方法，尤其涉及食品中致病性弯曲菌属微生 物的mPCR-DHPLC检测方法，同时还涉及检测所用的组合物，即试剂盒。

背景技术

弯曲菌感染是一种人畜共患病，在世界各地均有发生，可引起人类急性肠 炎、格林巴利综合症、反应性关节炎、Reiter’s综合症等多种疾病。本属的两个 耐热种(thermophilic campylobacter)：空肠弯曲菌(Campylobacter jejuni)和 结肠弯曲菌(Campylobacter coli)，几乎可从所有弯曲杆菌临床感染的病例中分 离。嗜热弯曲菌属细菌，尤其是空肠弯曲菌被认为是人类细菌性腹泻的主要病 原菌。在新西兰和美国，由空肠弯曲菌引发的食源性细菌感染在一定范围内已 经超过了沙门氏菌和志贺氏菌。动物(特别是家禽)是该菌的主要寄主，另外 生牛奶、未经加工的肉制品和未经处理的水也是主要载体。弯曲菌不易在食物 中生长，但是引起发病的感染剂量却很低，大约摄入400～500个菌体就可引发 肠道感染，这对禽类产品安全和人类健康造成了严重的威胁。国内针对食品微 生物中沙门氏菌、单增李氏菌、霍乱弧菌、金黄色葡萄球菌等的分子生物学检 测技术研究较为深入和广泛，但针对弯曲菌的快速、高通量、分型检测技术研 究则所见报道甚少。目前许多发达国家已对食品中的弯曲菌建立起较为完善的 监测和控制体系，而我国相关调查报道较少。

目前，对食品中常见弯曲菌的检测最主要的方法就是选择性富集培养，但 是由于该菌在样品中的数量极少，并且生长条件要求苛刻，因此很难从样品中 检出。近来的研究发现，在一些特定的条件下，弯曲菌还存在着一种“存在但不 可培养”的状态，这更是传统分离培养检测方法无法克服的难题。因此，建立一 种高效、快捷、高通量的致泻性大肠埃希氏菌分型鉴定技术是食品安全所面临 的急需解决的问题。

变性高效液相色谱(DHPLC)采用离子对反相高效液相色谱的原理，是通 过使用特殊的耐高温液相色谱分离柱同时采用温度调控的方式，对核苷酸片段 分子进行分析分离的方法，因此，也有人称该技术为温度调控离子对反相高效 液相色谱。该技术的发明为生命科学领域里的核酸分析提供了方便实用的技术 平台。其快速高通量、全自动化操作、准确度高、重复性好及敏感性高的优点 使其在核酸分析中具有无可替代的优势。DHPLC技术检测微生物是很好的培养 不依赖的混合微生物样本的分析平台，不仅能鉴定常见的微生物，还能鉴定不 常见的，苛刻的，和厌氧的细菌。该技术在已知和未知基因突变的检测和筛选、 基因分型、基因定量和长度多态性分析等领域已经得到广泛应用。

基于此，本发明人试图建立利用DHPLC的高效、快捷、简便的适宜临床检 测应用的特异而灵敏的食品中常见弯曲菌的检测方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种用于灵敏快捷地检测样品、尤其是检测食品中 常见弯曲菌，以判定待检样品是否受到污染的试剂盒及其检测方法。

首先，本发明所述的食品中常见弯曲菌检测试剂盒是：

1mL检测溶液含10mM Tris·Cl、50mM KCl、25mM MgCl₂、dNTP(dATP、 dGTP、dCTP和dTTP)各2.5mM、Taq DNA聚合酶5000U即5U/μL及四种常 见弯曲菌引物对各10μM、。

其中，待检测弯曲菌属微生物的特异性引物序列如下：

本发明还提供了利用上述试剂盒检测食品中常见弯曲菌的检测方法，包括 如下步骤：

①取1ul待测样品DNA溶液，加入10ul试剂盒溶液和14ul灭菌超纯水， 总体积25ul；5000r/min离心10s，然后按下列参数进行PCR扩增：

预变性：94℃，3min；

进入循环：94℃变性60s，56℃退火60s，72℃延伸60s，35次循环；

终止延伸：72℃，7min；

②DHPLC分析：色谱柱：PS-DVB & C18 DNASep色谱柱(4.6mm×50mm， 粒度3μm)；柱温：50℃；

流动相(体积比)：0.0min，55.0％缓冲溶液A，45.0％缓冲溶液B；

                0.5min，50.2％缓冲溶液A，49.8％缓冲溶液B；