[发明专利]添加在饲料中植酸酶的微量测定方法

说明书

[技术领域]

本发明涉及一种添加在饲料中植酸酶的微量测定方法。

[背景技术]

一、植酸酶在饲料中的应用及其测定方法

近年来，随着畜禽养殖业的发展和磷资源的消耗，磷酸氢钙价格连年攀升，已成为继蛋白质和能量之后又一大饲料原料；另一方面，饲料中添加大量无机磷也加剧了环境污染。因此，利用微生物植酸酶减少日粮中的磷酸氢钙用量越来越受到人们的青睐。

目前，植酸酶产品的种类与剂型繁多，确定科学的植酸酶以及添加到饲料后，质量检测与评判方法，对选择质优价廉的植酸酶产品尤为重要。植酸酶检测方法最初由德国巴斯夫公司推出，1个植酸酶活性单位定义为：在37℃和pH为5.5的条件下每分钟从浓度为0.005mol/L的植酸钠溶液中释放出1μmol无机磷所需要的植酸酶的数量。2002年，在这一定义的基础上，起草了饲用植酸酶活性测定方法的国家标准。标准适用于作饲料添加剂用的植酸酶产品，也适用于添加有植酸酶的配合饲料、浓缩饲料和添加剂预混合饲料，样品最低检出量为90U/kg。

植酸酶的基因片段一些来源于大肠杆菌，而另外一些商品植酸酶则来源于曲霉。大量的植酸酶分离纯化后性质鉴定表明，不同来源的植酸酶在分子量、等电点、最适温度和pH值上都有着明显的不同，并且在对底物的选择性上也有区别。来源于曲霉的植酸酶检测方法已于2002年正式发布(GB/T18634-2002)，但因为不同来源的植酸酶作用位点、最佳pH等均不同，用GB/T18634-2002测定来源于大肠杆菌的植酸酶，检测结果变异系数较大，无法准确测定，因此，需要有一种快速、简便，具有高度特异性、灵敏度、准确度的方法，测定植酸酶的活性以及添加在饲料中的植酸酶的活性，将会更有利于科学合理地制作配方，促进植酸酶产业的发展。

二、目前现有技术测定配合(全价)饲料中植酸酶样品的问题

(一)、加酶饲料中植酸酶活性测定的问题

1、加酶饲料中酶活测定的问题之一

酶的活性是测定其底物或产物的变化量，但是：酶降解的底物或生成的产物，在饲料中本身就存在，而且存在的量很大，其数量是酶引起的变化量的好多倍。

在酶活测定时：饲料中本来存在的大量底物或产物也会引起显色反应，对酶制剂引起的显色反应构成干扰，所以属于酶活测定的杂质。

由于饲料中本来存在的底物或产物量更大，会引起更深的显色反应，其所引起的吸光度变化值会远大于酶促反应底物显色所引起的吸光度值的变化。所以，加酶饲料中酶活检测的第一个问题：存在的杂质(本底)干扰。

2、加酶饲料中酶活测定的问题之二

酶制剂加入饲料后，1000～10,000倍的稀释，使得饲料中酶制剂的活性，低于可测的活性底线。这是加酶饲料中酶活测定的第二个问题：活性太低的问题。加酶饲料中酶的微量测定技术的关键之二是：设法浓缩酶的浓度，或采用常用比色法以外灵敏度更高的测定方法。

3、其它问题：

(1)酶与饲料中的某些成分的亲和性，导致酶的溶解不全，引起测定的误差。最典型的例子是某些来源的植酸酶。

(2)饲料中的少量内源酶对外源酶的干扰，等等。

三、目前现有技术测定配合(全价)饲料中植酸酶样品的缺点

现有测定方法(GB/T 18634-2002)中，“钼黄法”测定植酸酶含量的原理为：植酸酶在一定温度和pH条件下，水解植酸钠，生成正磷酸和肌醇衍生物，在酸性溶液中，用钒钼酸铵处理会生成黄色的[(NH₄)_3PO₄NH₄VO₃·16MoO₃]复合物，在波长415nm下进行比色测定。具体过程为：取待反应液(酶浓度约0.4U/mL)0.2ml，加入1.8ml 0.25mol/L的pH5.0乙酸缓冲液，37℃水浴预热5分钟，加入已预热至37℃的7.5mmol/L的植酸钠溶液4ml，37℃精确水解30分钟，加入4ml颜色终止液(1份100g/L钼酸铵溶液+1份2.35g/L偏钒酸铵溶液+2份1∶2水溶液的硝酸溶液)，反应后室温下静置10分钟，4000rpm离心10分钟。上清液以标准曲线的空白调零，在分光光度计415nm波长处测定样品空白和样品溶液的吸光值，根据实测吸光值计算植酸酶的活性。