[发明专利]添加在饲料中植酸酶的微量测定方法

权利要求书

1.一种添加在饲料中植酸酶的微量测定方法，特征在于，其步骤如下：

1试剂和溶液的配制

1.1乙酸缓冲液I，CH₃COONa的浓度c＝0.25mol/L：称取34.02g三水乙酸钠于1000ml烧杯中，加入900ml水搅拌溶解，用冰乙酸调节pH值至5.00±0.01，再转移至1000ml容量瓶中，并用蒸馏水定容至刻度；室温下存放2个月内有效；

1.2乙酸缓冲液II，CH₃COONa的浓度c＝0.25mol/L：称取34.02g三水乙酸钠，0.5g牛血清白蛋白于1000ml烧杯中，加入900ml水搅拌溶解，用冰乙酸调节pH值至5.00±0.01，再转移至1000ml容量瓶中，并用蒸馏水定容至刻度；室温下存放2个月内有效；

1.3植酸钠溶液，C₆H₆O₂₄P₆Na₁₂的浓度c＝7.5mmol/L：称取0.6929g植酸钠C₆H₆O₂₄P₆Na₁₂，相对分子质量为923.8，纯度为95％；精确至0.1mg，置于100ml烧杯中，用约80ml乙酸缓冲液I溶解，用冰乙酸调节pH值至5.00±0.01，转移至100ml容量瓶中，并用乙酸缓冲液I定容至刻度，现用现配，实际反应液中的最终浓度为5.0mmol/L；

1.4硝酸溶液：1份浓硝酸+2份水；

1.5钼酸铵溶液，100g/L：称取10g钼酸铵(NH₄)₆Mo₇O₂₄·4H₂O于50ml烧杯中加水溶解，再转移至100ml容量瓶中，加入1.0ml浓度为25％的氨水，用水定容至刻度；

1.6偏钒酸铵溶液，2.35g/L：称取0.235g偏钒酸铵NH₄VO₃于50ml烧杯中，加入2ml硝酸溶液及少量水，并用玻璃棒研磨溶解，再转移至100ml棕色容量瓶中，用水定容至刻度；避光条件下保存；

1.7颜色终止液：取2份硝酸溶液，1份钼酸铵溶液，1份钒酸铵溶液混合使用，现用现配；

1.8标准植酸酶，标明准确活性单位和类型；

2测定

2.1标准曲线

准确称取一定量的标准植酸酶，精确至0.0001g，于50ml容量瓶中，用乙酸缓冲液II溶解并定容至刻度，做两次稀释，使植酸酶活性为0.30U/mL左右，当日配制；

将上述植酸酶按表1用缓冲液II进行稀释，需要准确计算植酸酶的浓度，与样品一起反应测定，以植酸酶浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，列出直线回归方程y＝ax+b：

表1

  标准编号  酶活(U/mL)

  1  0.010  2  0.020  3  0.041  4  0.081  5  0.122

  1  0.010  6  0.162  7  0.244

2.2试样溶液的制备

2.2.1样品处理：取有代表性样品预冷至4℃，采取间断式粉碎全部粉碎，防止粉碎时饲料发热，通过0.45mm的标准筛，充分混匀后准确称取样品50.00g，加入500ml乙酸缓冲液II，在4℃环境下磁力搅拌45分钟，过滤以弃去初滤液50ml，取过滤液100ml完全准确移入透析袋中，置于4℃预冷的乙酸缓冲液I透析外液中，透析外液体积约为透析酶液体积的10倍，透析时间为20小时，透析10小时需换一次透析外液；透析后准确量取体积并记录；

2.2.2已知酶液配制 取标准植酸酶配制成酶活为0.05U/mL的酶液，取100ml，如步骤2.2.1的方法进行透析、测定；

2.2.3样品+已知酶 准确称取待测定饲料样品预冷至4℃，全部粉碎并通过0.45mm的标准筛，充分混匀后取样50.00g，于该样品中加入步骤2.2.2所得已知酶液500ml，在4℃环境下磁力搅拌45分钟，过滤以弃去初滤液50ml，取过滤液100ml完全准确移入透析袋中，置于4℃预冷的乙酸缓冲液I透析外液中，透析外液体积约为透析酶液体积的10倍，透析时间为20小时，透析10小时需换一次透析外液；透析后准确量取体积并记录，得加有已知酶的样品透析液；

2.3反应

取透析液1.0ml，加入1.0ml乙酸缓冲液I，37℃水浴预热5分钟，加入已预热至37℃的7.5mmol/L的植酸钠溶液4ml，37℃精确水解30分钟，加入4ml颜色终止液，反应后室温下静置10分钟，4000rpm离心10分钟；上清液以标准曲线的空白调零，在分光光度计415nm波长处测定样品空白和样品溶液的吸光值；根据实测吸光值计算植酸酶的活性：

取25mL试管按表2所示顺序进行操作，在反应过程中，从加入植酸钠溶液开始，向每支试管中加入试剂的时间间隔要绝对一致，37℃水解30min：

表2反应步骤、溶液用量

  反应顺序  样品、标准  样品空白(标准空白)

  1.加入乙酸缓冲液I  1.0ml  1.0ml(2.0ml)  2.加入待反应液  1.0ml  1.0ml  3.混合  √  √  4.37℃预热5min  √  √  5.依次加入植酸钠溶液  4ml  4ml(第二步)

  1.加入乙酸缓冲液I  1.0ml  1.0ml(2.0ml)  6.混合  √  √  7.37℃水解30min  √  √  8.依次加入终止液  4ml  4ml(第一步)  9.混合  √  √  总体积  10ml  10ml

2.4样品测定

反应后的试样在室温下静置10min，如出现混浊需在离心机上以4000r/min离心10min，上清液以标准曲线的空白调零，在分光光度计415nm波长处测定样品空白和样品溶液的吸光值，用直线回归方程计算植酸酶的活性；

2.5结果计算和表示

2.5.1植酸酶活性计算：

式中：C-----根据实际样液的吸光值由直线回归方程计算出的酶活性；

F-----试样溶液反应前的总稀释倍数；

m----试样重量；

2.5.2结果表示

两个平行样品的测定结果用算式平均值表示，保留整数。