[发明专利]蜱体内检测莱姆病病原的检测方法及试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及一种病原体检测技术，特别是用于检测蜱体内莱姆病病原的LAMP检测方法。

背景技术

莱姆病(Lyme disease)又称莱姆包柔体病或莱姆疏螺旋体病，是一种蜱传性的自然疫源性人兽共患螺旋体病，因首次在美国康涅狄格州的莱姆镇发现而得名。病原体为伯氏疏螺旋体，可分为10个基因型或组，我国已发现报道的莱姆病螺旋体有狭义伯氏疏螺旋体(Borrelia burgdorferi sensus stricto)、伽氏疏螺旋体(B.garinii)和嘎氏疏螺旋体(B.afzelii)三个基因型。目前已在全球30多个国家和地区报告有本病和自然疫源地存在，年发病人数在30万左右，仍有不断增多的趋势，在美国有“第二爱滋病”之称(Gratz N.Emerging and resurgingvector-borne disease.Ann Rev Entomol，1999，44：51)。1992年，世界卫生组织(WHO)将此病列为重点防治研究对象。我国于1986年首次在黑龙江省海林县林区发现了该病，到目前，我国29个省(区、市)均已发现有莱姆病分布，每年新发病例高达万余例，某些省份林区的发病率在1-40％。

人感染后的临床症状主要表现为慢性炎症性多系统损伤，除皮肤慢性游走性红斑、关节炎和慢性萎缩性肢皮炎外，常常会伴有心脏和神经系统的损伤，从而引起脑膜炎、路神经炎、运动及感觉神经根炎、神经丛炎、多发单神经炎小脑共济失调等等症状。严重影响人类健康。

由于本病是一类蜱传性疾病，所以探明媒介蜱的种类，为切断传播途径，控制本病的流行是十分重要的。现已发现，在北美主要的媒介蜱是肩突硬蜱、新节硬蜱和太平洋硬蜱，其中肩突硬蜱是主要的传播媒介，带菌率在12-100％；欧洲的传播媒介是篦子硬蜱和全沟硬蜱，篦子硬蜱的带菌率可达到40％；在我国，在全沟硬蜱、粒形硬蜱、锐跗硬蜱、长角血蜱、二棘血蜱、嗜群血蜱、台湾血蜱、微小牛蜱和森林革蜱等9种硬蜱体内分离到病原，其中全沟硬蜱、二棘血蜱和粒形硬蜱的带菌率最高，分别达到20-45％、16-40％和24％。研究证实在我国北方林区主要是全沟硬蜱，南方林区为二棘血蜱和粒形硬蜱传播本病。

到目前为止，在蜱体内检测本病病原的方法主要以聚合酶链式反应(PCR)和反向线状印迹(RLB)方法为主，但是PCR在检测本病原时常常表现为敏感性较低，同时需要复杂的操作系统——PCR仪；RLB虽然具有较好的敏感性，但是其操作复杂，对操作实验室的要求高。难以满足进行本病原的大规模调查的需要，参见Rauter C，Meuller M，Diterich I，et al.Critical evaluation ofurine-based PCR assay for diagnosis of Lyme borreliosis.Clin Diag Lab Immunol，2005，12：910-917；Morán-Cadenas F，Schneider H，et al.，A comparison of two DNAextraction approaches in the detection of Borrelia burgdorferi sensu lato from liveIxodes ricinus ticks by PCR and reverse line blotting.Vector Borne Zoonotic Dis.2007；7(4)：555-561)。

发明内容

本发明针对现有技术检测蜱体内莱姆病病原伯氏疏螺旋体时需要复杂的仪器和敏感性低的缺点，提供一种只需要常规的水浴锅就可以具有高敏感性的分子检测方法，这种方法的检测敏感性高于PCR方法，同时不需要复杂的操作系统，可以在普通实验室条件下实施检测，并具有操作简单、敏感性高、快速等特点。本发明同时提供这种应用检测方法的检测试剂盒。

本发明的蜱体内检测莱姆病病原检测方法是：以16S rRNA基因为靶基因，用专用软件设计出用环介导的恒温扩增技术用于蜱体内检测莱姆病病原伯氏疏螺旋体的引物，再从中选出莱姆病病原特异性区段的引物，将侍检蜱刺破后提取DNA，将所得DNA与反应缓冲液、所选出的特异性区段的引物反应混合物及DNA聚合酶混匀，进行扩增，扩增产物灭活后加入上样缓冲液，再置于含溴化乙锭的琼脂糖凝胶中，进行电泳检测，根据电泳后是否出现特定条带后即可得出被检蜱是否带有莱姆病病原。