[发明专利]一种利用微小RNA高效抑制曼地亚红豆杉细胞合成C-14位氧化紫杉烷的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种有效抑制曼地亚红豆杉(Taxus x media)细胞生物合成C-14位氧化紫杉烷 的方法。它属于上世纪80年代在植物细胞培养的基础上发展起来的基因工程领域。植物细胞 悬浮培养技术作为一种新兴的生物技术，能够在大型的生物反应器内大规模生产出有用的药 物，具有重要的应用价值。

背景技术

紫杉醇(taxol)是Wall等首次从短叶红豆杉(Taxus Brevifolia)树皮中分离得到的一种重要 的二萜类植物次生代谢产物。在临床已用于治疗卵巢癌、肺癌、膀胱癌、子宫癌及AIDS相关 的Karposis肉瘤等的治疗，是目前应用最广泛的天然抗癌药物之一。然而，目前紫杉醇主要从 红豆杉植物树皮中提取，生产1kg的紫杉醇就需要2000-3000棵红豆杉的2000磅重的树皮。由 于乱砍滥伐，红豆杉野生资源遭受到了严重破坏。为解决这一危机，国内外在人工栽培、紫 杉醇化学半合成与全合成、内生真菌、红豆杉细胞培养等领域进行了探索。其中红豆杉细胞 培养法被认为是最有发展前途的途径之一。同时，随着紫杉醇生物合成途径的逐步阐明及越 来越多的关键酶和相关酶的基因的克隆和功能重组表达，利用基因工程方法对红豆杉细胞从 基因水平上进行改造或对产紫杉醇的内生真菌菌种进行改造已有可能。已有以大肠杆菌为宿 主菌组合紫杉烯合成酶等4种酶的基因产生紫杉烯的报道，且产率达到1.3mg/L，为天然产 物生物合成基因的应用提供了借鉴。如果能将细胞培养与基因工程法结合，则很有可能成为 解决紫杉醇资源短缺的有效途径。红豆杉紫杉醇生物合成全过程约20步酶促反应，其中紫杉 二烯合酶、紫杉二烯-5a-羟化酶、紫杉烷10β-羟化酶、紫杉烷-3a-羟化酶、紫杉二烯-5a-乙酰 转移酶、紫杉烷-2a-苯甲酰转移酶、10-去乙酰巴卡亭III-10β-乙酰转移酶、3-氨基-3-苯基丙酰 转移酶和3-N-去苯甲酰-2-脱氧紫杉醇苯甲酰转移酶等主要的相关酶基因已成功克隆与表达。 其中，紫杉烷14β-羟基化酶(简称14OH)存在于包括紫杉醇在内的各种C-13氧取代的紫杉烷生 物合成分支途径中，对该基因表达进行抑制，则有可能阻断中间产物流向C-14氧取代的紫杉 烷，而改向生成包括紫杉醇在内的C-13氧取代的紫杉烷的途径，从而大幅度提高后者的产量。 经文献检索：Kim等，Journal of Microbiology and Biotechnology，2000，10(1)：91-94，Ketchum 等，Plant Cell Reports，2007，26(7)：1025-1033和国际专利：WO2007/081772，分别利用红豆杉的 细胞悬浮培养系进行了外源基因的转化试验。Kim的实验中研究了GFP蛋白在东北红豆杉 (Taxus cuspidata)细胞中的表达，他们提供了GFP蛋白表达的蛋白质印迹的证据，但他们没 有进行任何外源目的基因的转化实验。Ketchum等的研究中也进行了东北红豆杉的转化实验， 但他们用的是野生型的根癌和发根农杆菌，同样也没有开展任何外源目的(功能)基因的转 化工作。国际专利WO2007/081772尽管进行了曼地亚红豆杉外源目的(功能)基因的转化工 作，但没有涉及到到紫杉烷14β-羟基化酶基因的遗传操作，更没有涉及微小RNA基因的利用。 在利用微小RNA高效抑制曼地亚红豆杉细胞合成C-14位氧化紫杉烷，降低曼地亚红豆杉细胞 C-14位氧化紫杉烷含量方面，国内外均还未见报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种利用微小RNA高效抑制曼地亚红豆杉细胞合成C-14位氧化紫 杉烷的方法。它包括如下步骤：

(1)从水稻基因组DNA中克隆得到微小RAN基因前体；

(2)构建载体，载体宿主菌为根癌农杆菌；

(3)农杆菌浸泡法转化红豆杉细胞；

(4)筛选转基因细胞；

(5)C-14氧取代的紫杉烷含量分析。

本发明所述方法，其中：微小RNA通过抑制曼地亚红豆杉紫杉烷14β羟基化酶基因表达 的方式来抑制红豆杉细胞合成C-14氧取代的紫杉烷。

本发明所述方法，其中C-14位氧化紫杉烷为sinenxan A、sinenxan C和Yunnanxane。

本发明所述方法，其中微小RAN基因前体为水稻微小RNA分子miRNA415，载体质粒 为pEGAD，含有绿色荧光基因。