[发明专利]一种双单链抗体强化融合蛋白dFv-LDP-AE及其制备方法和应用

说明书

技术领域：

本发明涉及以连续两个单链抗体为载体的肿瘤导向融合蛋白及其制备方法和在抗肿瘤靶向治疗药物中的应用。 

背景技术：

IV型胶原酶能够降解IV型胶原等细胞外基质组分，破坏基底膜及细胞外基质的完整性，与肿瘤生长、侵袭和转移有密切的关系。在人类前列腺癌、结直肠癌、乳腺癌、黑色素瘤、胰腺癌等恶性程度较高的肿瘤细胞和组织中均存在IV型胶原酶的高表达，而抑制其活性，可以抑制肿瘤细胞的生长和转移。scFv是抗体工程小型化过程中研究比较多的对象，它由一个重链可变区VH和一个轻链可变区VL，通过15个小分子氨基酸短肽连接而成，其分子量约为27kDa。本发明中所用的scFv是由本实验室开发出的一种抗IV型胶原酶单链抗体片段，其与力达蛋白LDP组成融合蛋白后的分子量为37kDa，与发色团组装后的免疫偶联物Fv-LDP-AE，在荷瘤小鼠中展现了较好的治疗效果(专利号：ZL 03 1 50240.7)。 

高活性的‘弹头’力达霉素(LDM)，亦称为C-1027，是从我国湖北省潜江县土壤中分离得到的一株由球孢链霉菌(Streptomyces globisporus，菌种保藏编号：CGMCC No.0704)产生的烯二炔类抗生素，是迄今报道过的对肿瘤细胞杀伤作用最强的大分子肽类抗肿瘤抗生素。体内动物实验表明，LDM对小鼠结肠癌26有非常显著的疗效，对移植裸鼠的人肝癌Bel-7402[World J Gastroenterol，2005，11(26)：3980-3984]和胰腺癌[Oncol Rep.，2007，17(6)：1445-51]等多种裸鼠移植人肿瘤均有较好疗效。力达霉素由两部分组成：一为烯二炔发色团(activeenediyne，AE)，具有细胞毒作用，是力达霉素的效应基团，但是不太稳定；另一部分为110个氨基酸组成的辅基蛋白(LDP)，其对发色团的稳定起到保护作用。发色团和辅基蛋白，两者通过非共价键结合，在有机溶剂中可以拆分为二，还可以重建。因此，力达霉素以其独特的分子结构，可以成为构建新型单抗导向药物 的理想‘弹头’药物[中国医学科学院学报，2001，23(6)：563-567]。 

小型化、高效化是解决当前抗体药物治疗所遇到问题的有效途径之一。然而，小型化却不可避免造成亲和力的降低和在体内停留时间的缩短，从而导致药物在肿瘤部位积累的相对比例下降。本发明所涉及的dFv-LDP-AE，是以连续的两个抗IV型胶原酶单抗3611的单链抗体scFv为载体，强效抗肿瘤抗生素力达霉素为‘弹头’，采用DNA重组和分子重建技术相结合而制备的肿瘤导向免疫融合蛋白。研究表明，dFv-LDP-AE在体外对肿瘤细胞有强烈的杀伤活性，体内实验对小鼠移植性肝癌22和裸鼠移植性人肝癌Bel-7402均有很显著的疗效，相对于先前构建的类似融合蛋白Fv-LDP-AE(专利号：ZL 03 1 50240.7)有更好的抑瘤效果。小鼠活体成像显示，dFv-LDP较Fv-LDP有更好的组织分布行为，在肿瘤部位能够快速、长时间富集。本发明所说的双单链抗体强化融合蛋白dFv-LDP-AE，迄今为止，尚未见有国内外的相关报道。 

本发明的目的是，提供一种相对于单链抗体强化融合蛋白来讲，亲和力更高，体外肿瘤细胞杀伤活性更强，体内抗肿瘤治疗效果更好的双单链抗体强化融合蛋白dFv-LDP-AE，为肿瘤靶向治疗实用化创造有利条件。 

发明内容：

本发明涉及的双单链抗体强化融合蛋白dFv-LDP-AE系由两个抗IV型胶原酶单抗3G11的单链抗体scFv、力达霉素辅基蛋白LDP和力达霉素活性发色团AE组成，分子量为67.1kDa，其融合蛋白dFv-LDP的基因编码序列为1905bp，由635个氨基酸组成。 

本发明的技术方案包括以下步骤： 

1、重组表达质粒pET-dFv-LDP的构建：重组质粒pKFv1027含有scFv和LDP基因，由本实验室构建。大肠杆菌菌种E.coli.DH5α和大肠杆菌表达质粒pET-30a(+)为本试验保存的Invitrogen公司的产品。PCR引物由北京英俊公司合成，分别引入相应的酶切位点。 

单链抗体scFv两条5’端引物(Pa1和Pa2)： 

Pa1：5’-GGAATTCCATATGCAGGTGAAGCTGCAG-3’(下划线为Nde I酶切位点)；