[发明专利]一种双单链抗体强化融合蛋白dFv-LDP-AE及其制备方法和应用

权利要求书

1.一种双单链抗体强化融合蛋白dFv-LDP-AE，其特征是所述dFv-LDP-AE融合蛋 白的编码基因如SEQ ID NO.1所示。

2.制备权利要求1强化融合蛋白dFv-LDP-AE的方法，其特征是所述方法包括以 下步骤：

A)重组表达质粒pET-dFv-LDP的构建；

B)融合蛋白dFv-LDP在大肠杆菌中的诱导表达；

C)融合蛋白dFv-LDP的纯化及复性；

D)融合蛋白dFv-LDP的生物学活性测定；

E)强化融合蛋白dFv-LDP-AE的制备。

3.如权利要求2所述的制备方法，其特征是运用基因工程技术分别克隆得到力 达霉素辅基蛋白LDP基因和抗IV型胶原酶抗体单链抗体scFv基因，并将LDP 基因亚克隆至大肠杆菌表达质粒pET-30a(+)，构建重组质粒pET-LDP，再将 scFv基因连入到pET-LDP中，构建融合基因重组表达质粒pET-Fv-LDP；最后 再将另外一个scFv基因插入到表达载体pET-Fv-LDP中，生成融合基因表达 质粒pET-dFv-LDP。

4.如权利要求2所述的制备方法，其特征是将pET-dFv-LDP转化到大肠杆菌宿 主菌中，经IPTG诱导表达，获得主要以包涵体形式存在的融合蛋白 dFv-LDP。

5.如权利要求2所述的制备方法，其特征是通过镍亲和层析纯化融合蛋白 dFv-LDP，再通过分步透析复性、超滤浓缩，制备出活性融合蛋白dFv-LDP。

6.如权力要求2所述的制备方法，其特征是采用ELISA和免疫荧光法检测融合 蛋白dFv-LDP对IV型胶原酶和肿瘤细胞的免疫反应性；并采用流式细胞仪分 析肿瘤细胞表面结合后的融合蛋白dFv-LDP被内化的情况。

7.如权利要求2所述的制备方法，其特征是融合蛋白dFv-LDP与经甲醇提取法 制备的力达霉素活性发色团AE进行分子组装，从而获得强化融合蛋白 dFv-LDP-AE。

8.权利要求1所述强化融合蛋白dFv-LDP-AE在制备抗肝癌导向药物中的应用。