[发明专利]乳酸脱氢酶表达盒、转化酵母和乳酸的制造方法

说明书

技术领域

本发明涉及乳酸脱氢酶表达盒、具有该盒的转化酵母和包括培养该酵母的乳酸的制造方法，更具体的是，涉及高乳酸生产能力的乳酸脱氢酶表达盒、具有该盒的转化酵母和包括培养该酵母的乳酸的制造方法。

背景技术

近年来，在向资源循环型社会构建的趋势下，以植物等的生物量作为原料的聚合物备受关注。这其中，已经清楚了，聚乳酸(以下有时简称为“PLA”)作为生物量原料的聚合物具有优异的性质。

PLA的原料乳酸，通过培养以乳杆菌属(Lactobacillus)和乳球菌属(Lactococcus)为代表的总称为所谓乳酸菌的微生物来制造。使用乳酸菌的乳酸的生产，其由糖产生的乳酸收率和乳酸生产速度优异。但是，获得的乳酸为L-乳酸和D-乳酸的混合物。因此，在光学纯度上存在问题。在PLA生产中使用的乳酸需要高光学纯度。

人们尝试制造光学纯度高的乳酸。例如，人们尝试了采用转化酵母，生产L-乳酸和D-乳酸(例如，专利文献1-3，非专利文献1)。酵母原本不具有生产乳酸的能力。在这些文献中报道了，通过基因重组技术，将编码将丙酮酸转化为乳酸的乳酸脱氢酶的基因导入酵母，获得了光学纯度非常高的乳酸。另一方面，在通过酵母进行的乳酸生产中，乳酸收率、乳酸生产速度都比乳酸菌要差。因此，为了使用酵母以低成本生产乳酸，需要同时提高乳酸收率、乳酸生产速度。

为了使乳酸收率、乳酸生产速度一起提高，开发了一边用分离膜过滤具有乳酸生产能力的酵母，一边进行培养的技术(参照例如专利文献4)。但是，即使采用这种技术，也存在在培养过程中乳酸收率、乳酸生产速度都逐渐降低的问题。

专利文献1：特表2001-516584号公报

专利文献2：特开2003-93060号公报

专利文献3：特开2005-137306号公报

专利文献4：国际公开第2007/97260号小册子

非专利文献1：Ishida，Takahashi等人，J.Biosci.Bioeng，101(2)，p.172-177，(2006)

发明内容

发明要解决的问题

本发明鉴于上述问题，其目的在于提供使得同时实现高的光学纯度、乳酸收率和乳酸生产速度成为可能的、在一边用分离膜过滤具有乳酸生产能力的酵母一边进行连续培养中为了防止乳酸收率和乳酸生产速度降低所必要的编码乳酸脱氢酶的基因表达盒、具有该盒的酵母和培养该酵母而制造乳酸的方法。

用于解决问题的方法

本发明人为了解决上述问题，进行了积极的研究，结果发现，在一边用分离膜过滤具有乳酸生产能力的酵母一边进行连续培养中，通过一边用分离膜过滤具有乳酸脱氢酶表达盒的酵母，其中所述乳酸脱氢酶表达盒含有培养开始后50小时以后基因表达量为全部基因平均相对表达量的5倍以上的基因的启动子，一边进行培养，能够不导致乳酸收率和乳酸生产速度降低，稳定地长时间连续培养，从而完成了本发明。

也就是说，本发明为一种在启动子的下游连接了编码乳酸脱氢酶的基因的乳酸脱氢酶表达盒，其特征在于该启动子是在一边用分离膜过滤具有乳酸生产能力的酵母一边进行连续培养中，培养开始后50小时之后基因表达量为全部基因平均相对表达量的5倍以上的基因的启动子。优选前述启动子为指数缺陷的抑制(suppression of exponential defect)1基因(SED1基因)、细胞壁关联蛋白质2基因(CWP2基因)或烯醇化酶1基因(ENO1基因)的启动子，更优选地为包含选自以下(a)～(c)的碱基序列的启动子。

(a)包含序列号1～3任一项所示的碱基序列的启动子；

(b)包含与含有序列号1～3任一项所示的碱基序列或其一部分的碱基序列在严格条件下杂交的碱基序列的启动子；

(c)包含在序列号1～3任一项记载的碱基序列中，缺失、替代和/或添加了1个或多个碱基的碱基序列的启动子。

根据本发明的其它优选方式为含有以下的选自(a)组的启动子和选自(b)组的编码乳酸脱氢酶的基因的乳酸脱氢酶表达盒。

(a)

(1)包含序列号1～3任一项所示的碱基序列的启动子；

(2)包含与含有序列号1～3任一项所示的碱基序列或其一部分的碱基序列在严格条件下杂交的碱基序列的启动子；

(3)包含在序列号1～3任一项所示的碱基序列中缺失、替代和/或添加了1个或多个碱基的碱基序列的启动子；

(b)

(1)包含序列号4～6任一项所示碱基序列的编码乳酸脱氢酶的基因；