[发明专利]合酶抑制剂筛选方法

说明书

涉及序列表

本申请包含序列表。

发明领域

本发明涉及宿主细胞的选择，其在特定的生长条件下表达目的活性酶；在这些条件下，不表达活性酶的细胞不能生长。细胞中至少一种必需组分的合成受到向生长培养基加入的一种或多种合成抑制剂抑制，所以如果产生目的活性酶，必需组分只能由宿主细胞从培养基获得。

发明背景

商业的酶生厂者的目标是能进行快速而简单的选择方法，用于鉴定表达目的活性酶的那些宿主细胞。存在公开各种筛选方法的很多出版物，但是提供用于实际选择的方法的很少。大多数基于选择的方法传统地使用抗生素抗性标记物。对改进的选择方法的需要一直存在。

发明概述

在第一方面，本发明涉及用于选择分泌一种或多种目的活性酶的至少一种宿主细胞的方法，所述方法包括如下步骤：

a)提供包含一种或多种合酶抑制剂的生长培养基，该抑制剂抑制宿主细胞中至少一种必需化合物的合成，并且进一步包括一种或多种组分，其在存在一种或多种目的活性酶的情况下可转化为至少一种必需化合物，从而允许宿主细胞生长；

b)在步骤(a)的生长培养基中或其上培养宿主细胞；和

c)选择能在步骤(a)的生长培养基中或其上生长的至少一种宿主细胞，所述宿主细胞分泌一种或多种目的活性酶。

发明详述

本发明的第一方面涉及用于选择分泌一种或多种目的活性酶的至少一种宿主细胞的方法，所述方法包括如下步骤：

a)提供包含一种或多种合酶抑制剂的生长培养基，该抑制剂抑制宿主细胞中至少一种必需化合物的合成，并且进一步包括一种或多种组分，其在存在一种或多种目的活性酶的情况下可转化为至少一种必需化合物，从而允许宿主细胞生长；

b)在步骤(a)的生长培养基中或其上培养宿主细胞；和

c)选择能在步骤(a)的生长培养基中或其上生长的至少一种宿主细胞，所述宿主细胞分泌一种或多种目的活性酶。

宿主细胞

本发明还涉及重组宿主细胞。将包含本发明的多核苷酸的载体导入宿主细胞，使载体如前所述作为染色体整合体或自复制的染色体外载体而保持。术语“宿主细胞”包括亲本细胞的任何后代，其可由于复制过程中发生的突变而不同于亲本细胞。宿主细胞的选择很大程度上依赖于编码多肽的基因及其来源。

宿主细胞可以是可用于本发明的多肽的重组生产的任何细胞，例如，原核或真核细胞。

原核宿主细胞可以是任何革兰氏阳性细菌或革兰氏阴性细菌。革兰氏阳性细菌包括，但不限于，芽孢杆菌属(Bacillus)、链球菌属(Streptococcus)、链霉菌属(Streptomyces)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、肠球菌属(Enterococcus)、乳杆菌属(Lactobacillus)、乳球菌属(Lactococcus)、梭菌属(Clostridium)、地芽孢杆菌属(Geobacillus)和海洋芽孢杆菌属(Oceanobacillus)。革兰氏阴性细菌包括，但不限于，大肠杆菌(E.coli)、假单胞菌属(Pseudomonas)、沙门氏菌属(Salmonella)、弯曲杆菌属(Campylobacter)、螺杆菌属(Helicobacter)、黄杆菌属(Flavobacterium)、梭杆菌属(Fusobacterium)、泥杆菌属(Ilyobacter)、奈瑟氏菌属(Neisseria)和脲原体属(Ureaplasma)。

细菌宿主细胞可以是任何芽孢杆菌属细胞。可用于实施本发明的芽孢杆菌属细胞包括，但不限于，嗜碱芽孢杆菌(Bacillus alkalophilus)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)、短芽孢杆菌(Bacillus brevis)、环状芽孢杆菌(Bacillus circulans)、克劳氏芽孢杆菌(Bacillus clausii)、凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)、坚强芽孢杆菌(Bacillus firmus)、灿烂芽孢杆菌(Bacillus lautus)、迟缓芽孢杆菌(Bacillus lentus)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)、短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)和苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)细胞。