[发明专利]新型葡萄糖脱氢酶

说明书

技术领域

本发明涉及一种新型葡萄糖脱氢酶(GDH)，其可以用作用于测量葡萄糖浓度的试剂和葡萄糖传感器。本发明还涉及生产所述酶的方法，涉及用于定量葡萄糖的组合物，所述组合物包含所述酶和含有所述酶的葡萄糖传感器。

发明背景

NAD(P)-依赖性葡萄糖脱氢酶(EC 1.1.1.47；以下，“葡萄糖脱氢酶”有时称为“GDH”，并且“NAD(P)-依赖性葡萄糖脱氢酶”称为“NAD(P)-GDH”)是一种主要用于血液葡萄糖浓度测量的酶。该催化剂催化下述反应：

D-葡萄糖+NAD(P)→D-葡糖酸-δ-内酯+NAD(P)H

葡萄糖氧化酶也已知为可以用于血液葡萄糖测量的一种酶。然而，据说该酶具有这样的问题，即使用葡萄糖氧化酶进行葡萄糖浓度测量受溶解的氧浓度的影响，原因在于该酶可以利用分子氧作为电子受体。由于葡萄糖脱氢酶不受该溶解的氧的影响，近年来该酶已经用作血液葡萄糖测量的主要酶。GDH酶包括NAD(P)-依赖性GDH，吡咯并喹啉醌(pyrroloquinoline quinone)(PQQ)-依赖性GDH，和黄素-依赖性GDH。PQQ-依赖性GDH，诸如鲍氏不动杆菌(Acinetobacter baumannii)-来源的GDH，具有底物特异性的问题，其中PQQ-依赖性GDH与其与葡萄糖一样与麦芽糖反应。已知的黄素-依赖性GDH的实例包括土曲霉(Aspergillus terreus)-来源的GDH。黄素-依赖性GDH具有比PQQ-依赖性GDH更严格的底物特异性。然而，黄素-依赖性GDH不必然具有充分的底物特异性，因为相对于其与葡萄糖的反应性，其与木糖的反应性约为9％。此外，黄素-依赖性GDH具有至多约50℃的温度稳定性，这是不充分的。

在已知类型的NAD(P)-GDH中，杆菌细菌(Bacillus bacteria)-来源的NAD(P)-GDH是公知的。例如，已经报道枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)，巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)，蜡状芽孢杆菌(Bacilluscereus)等作为生产GDH的菌株。尽管所述细菌-来源的NAD(P)-GDH具有相对高的底物特异性，但是其热稳定性至多约为50℃，因此是不充分的。

超嗜热古细菌(Hyperthermophilic archaea)是系统分类为古细菌(Archeae)的微生物，并且可以在90℃以上生长，或具有80℃以上的最适生长温度。来源于超嗜热古细菌的酶通常具有高的耐热性。已经从超嗜热古细菌分离了许多耐热性酶，并且在工业上应用。NAD(P)-GDH也分离自超嗜热古细菌，并且已经研究了其特征。在1986年、1989年和1997年分别报道了硫磺矿硫化叶菌(Sulforobus solfataricus)-来源的GDH(非专利文献1)，嗜酸热原体(Thermoplasma acidophilum)-来源的GDH(非专利文献2)，和顽固热变形菌(Thermoproteus tenax)-来源的GDH(非专利文献3)。尽管这些酶具有极好的耐热性，但是与细菌来源的酶相比，它们具有极差的底物特异性。当使用NADP作为辅酶时，硫磺矿硫化叶菌-来源的GDH具有更广泛的底物特异性，并且在40mmol/L的底物浓度作用在半乳糖或木糖上比作用在葡萄糖上更强。当使用NAD作为辅酶时，硫磺矿硫化叶菌-来源的GDH对于葡萄糖的特异性相对增加，但是其针对木糖的活性仍然很高，即，相对于其针对葡萄糖的活性约为26％。当使用NADP作为辅酶时，嗜酸热原体(T.acidophilum)-来源的GDH针对半乳糖的活性相对于其针对葡萄糖的活性为70％。顽固热变形菌(T.tenax)-来源的GDH也与木糖高度反应。在血液葡萄糖浓度测量中，使用具有低底物特异性和与除葡萄糖外的物质的高反应性的GDH导致不准确的血液葡萄糖测量，并且因此是非常不利的。然而，来源于超嗜热古细菌且具有80℃以上的高耐热性和针对葡萄糖的高特异性的NAD(P)-GDH尚是未知的。

非专利文献1：Giardina P等，Biochem.J.(生物化学杂志)，卷239，第517-522页(1986)

非专利文献2：Smith LD等，Biochem.J.(生物化学杂志)，卷261，第793-797页(1989)

非专利文献3：Siebers B等，Arch.Microbiol.(微生物学报)，卷168，第120-127页(1997)

发明内容

发明要解决的问题