[发明专利]用于杂交核酸的方法

说明书

本发明涉及核酸与用于操作、分离、检测或扩增核酸的寡核苷酸-寡聚阳离子缀合物(oligonucleotide-oligocation conjugate)的杂交，以及其在分子生物学和诊断领域中的应用。

基于核酸的技术广泛用于细胞和分子研究以及用于诊断。该技术依赖于合成的寡核苷酸与其互补核酸链之间的序列识别。亲和力和特异性是确定任何基于核酸杂交的测定的效率的两个主要特征。

已开发了不同的方法来改进核酸杂交。其中，一个方法是减少带负电荷的核酸链之间的静电排斥。最近，包括将阳离子基团接枝至寡核苷酸且完全基于用于寡核苷酸合成的亚磷酰胺化学的自动化固相合成公开于WO 2007/069092中。所得的寡核苷酸-寡聚阳离子缀合物经显示通过减少链间磷酸排斥来稳定与短互补序列的杂交(Pons等人，2006)。

如同海底捞针一样，提高复杂核酸生物样品例如总基因组中的独特序列的特异性检测是更加困难的挑战。在这样的情况下，预期寡核苷酸-寡聚阳离子缀合物的阳离子部分非特异性结合基因组DNA的磷酸基团，从而减少对靶向的序列的特异性识别。当聚阳离子是聚胺时，该问题可变得更加尖锐，如WO 2007/069092和(Pons等人，2006)中所举例说明的。事实上，聚胺例如精胺或亚精胺天然地与原核和真核细胞中的基因组DNA相互作用(综述于Tabor和Tabor，1984；Pegg等人，1986)。此外，已确定，由于控制核酸碱基配对相互作用的机制，结合亲和力与序列特异性通常负相关(Demidov和Frank-Kamenetskii，2004)。因此，预期用于靶向整个基因组中的特定序列的寡核苷酸-寡聚阳离子缀合物耐受错配，从而导致特异性的降低。

本发明公开了预料之外的发现，即从WO 2007/069092中描述的分子中特异性选择的寡核苷酸-寡聚阳离子缀合物对于它们的靶序列显示了非常高的亲和力和令人惊讶的严格特异性，从而导致基于杂交的方法的总体改进。特别地显示，所述寡核苷酸-寡聚阳离子缀合物改善了聚合酶链式反应。

有利地，与标准寡核苷酸相比，所述寡核苷酸-寡聚阳离子缀合物作为引物和探针特别有效。“标准寡核苷酸”是指包含天然核碱基(nucleobase)的未修饰的寡核苷酸。

因此，本发明的目的是提供杂交方法，其基于靶向性核酸使用特定寡核苷酸-寡聚阳离子缀合物。

本发明的另一个目的涉及寡核苷酸-寡聚阳离子缀合物作为引物或探针的用途。

根据另一个目的，本发明涉及所述缀合物的生物学应用。

通过与寡核苷酸-寡聚阳离子缀合物杂交来检测、分离、扩增或操作样品中的靶核酸的方法包括使所述核酸与寡核苷酸-寡聚阳离子缀合物反应，所述缀合物包含至少直接地或通过连接体连接在一起的A_i和B_j部分，

其中

.A_i是i聚体寡核苷酸，i＝3至50，其中A_i是具有天然发生的或非天然发生的核碱基和/或戊呋喃糖基(pentafuranosyl)和/或天然磷酸二酯键的寡聚体，其任选地包含标记物基团

.B_j是j聚体有机寡聚阳离子部分，j＝1至50，其中B是

-HPO₃-R₁-(NH-R₂)_n-NH-R₃-O-，其中R₁、R₂和R₃是相同或不同的低级亚烃基(alkylene)，当n大于1时，NH-R₂部分是相同的或不同的；

-HPO₃-R₁-CH(X)-R₃-O-，其中R₁和R₃是相同或不同的低级亚烃基，X是腐胺、亚精胺或精胺残基；

“低级亚烃基”，如说明书和权利要求中所使用的，是指任选地经取代的C1-C6线性、分支或环状亚烃基。

A_i选自脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸和非天然发生的核碱基例如锁(LNA)核苷酸、PNA以及它们的化学修饰物或取代物例如硫代磷酸酯(phosphorothioate)(也称为硫代磷酸酯(thiophosphate))、2′-氟或2′-O-烷基。

A_i可包含生色团/荧光团和/或猝灭基团，或化学部分例如氨基或巯基修饰剂、间隔子基团(spacer group)、生物素、疏水链、胆固醇衍生物、抗原、蛋白质、肽、磷酸基团或糖。