[发明专利]基于聚合酶的单分子测序

说明书

发明领域

本发明涉及一种通过利用核酸聚合酶的活性，对单独的核酸分子进行核酸测序的新的荧光光谱法和分析平台(基于聚合酶的单分子测序)。

发明背景

人类基因组的首次测序在生物、生物医药和健康领域开启了一个新的时代。这一伟业有赖于全世界持续超过十年的艰苦努力，并且花费了超过20亿美元。近来，新的技术，例如由Solexa/Illumina、Roche/454 Life Sciences和ABI提供的那些(所说的“第二代”测序技术)，已经成数量级地提高了人类基因组测序的速度并降低了其成本；2008年，这一成本已达到约100,000美元。这些数据清楚地表明，对于研究大量个体、采用测序用于药物基因组学和个性化药物、监控个体一生当中基因组的变化(基因组再测序)、鉴别蛋白质的结合位点(例如用ChipSeq方法)、发现新基因和小RNAs的序列编码以及比较健康细胞和肿瘤细胞的基因组，测序仍然是一种非常昂贵的方法。为了使这些应用更能负担得起，新的测序技术是必需的；这些技术的绝大多数包括对单独的DNA分子进行测序，并且往往被称为“第三代”测序技术。开发此类技术已受到许多国家机构的鼓励，包括美国国立卫生研究院(USNational Insitutes of Health)新方案，该方案旨在到2015年开发出能够在一天内对人类基因组进行测序且具有99.9％的准确性的方法，并且成本仅为1000美元。

几种现有的DNA测序法都以核酸聚合酶的活性为基础，核酸聚合酶是从核酸模板(DNA或RNA)读取信息，并且把信息复制到一条新的核酸链上的蛋白质。例如，DNA聚合酶(DNAPs)读取DNA模板中的信息，并将其复制到新的DNA链上；RNA聚合酶(RNAPs)读取DNA模板中的信息，并将其复制到新的RNA链上。DNAPs更为普遍地用于测序；例如，SangerDNA测序法(完成人类基因组首次测序所使用的主要方法)基于DNAP的活性将双脱氧核苷酸(作为链终止子)加入到新的DNA链上。基于DNAP的测序需要DNA模板和用于起始复制过程的DNA引物。

RNAPs已被用于测序，其使用不太广泛；基于RNAPs的测序模式已知为转录测序。在过去，转录测序大量使用(即其中数十亿的分子被同时探测)；其依赖于常用于RNA体外合成的被表征清楚的单一亚单位噬菌体RNAPs(例如细菌噬菌体T7或SP6RNAP)。转录需要启动子DNA(可以采用PCR或连接反应引入)；然而，比较基于DNA聚合酶的测序，它不需要起始引物。此外，转录测序与每个单DNA分子的若干个测序读取结果(sequencing reads)相一致，因为若干RNAP可以在同一个DNA上同时进行，因此提高了对每个分子可能读取的数量和重新获得的序列的准确性。近来，报道了采用大肠杆菌RNAP，以高分辨度光镊设备进行的原理论证性单分子实验，表明了单分子转录DNA测序的可行性。

在这里我们描述了一种DNA测序策略，该策略利用了核酸聚合酶进行的模板引导的实时核酸合成(一种“通过合成进行测序”的方法)。具体地，我们描述了一种采用了RNA合成酶进行的单RNA合成的实施。我们注意到该策略的主要思想与基于其它核酸聚合酶，例如DNAP和反转录酶的测序完全一致。我们描述了用于确定每一个被加入的碱基的单颜色方案和多颜色方案。两种方法都需要表面固定化和全内反射荧光(TIRF)显微术，包括Kapanidis小组在内的几个实验室可以提供这些技术。此外，两种方法都基于5’修饰的三磷酸核苷(NTPs)的有效加入，该5’修饰的三磷酸核苷在每个NTP的γ-(或β-)磷酸上携带淬灭剂；该淬灭剂能够借助于荧光的确定碱基，并且在每一个加入循环结束时被释放。

专利号为7,052,847的美国专利描述了一种对靶核酸分子进行测序的方法，包括提供靶核酸分子的混合物、互补引物、核酸聚合酶和在活性位点被加入到不断延长的核酸链的多种类型核苷酸；和在适合形成不断延长的核酸链的条件下，通过模板引导的引物延伸，使混合物进行聚合反应；以及以光学方法鉴定核苷酸加入到不断延长的核酸链的时序。

申请号为2005/2148849的美国专利申请描述了用于确定多核苷酸序列的方法，包括以下步骤：在足以诱导酶活性的条件下，将靶多核苷酸与酶反应，该酶能够和多核苷酸反应并且沿着该多核苷酸处理，以及检测当该酶沿着多核苷酸处理时酶的构象变化。构象变化的检测通过测定连接到酶上的单一荧光团的变化而进行。