[发明专利]蛋白质的提纯方法

说明书

技术领域

本发明涉及蛋白质的提纯方法。具体地说，本发明涉及简便地从含有以动物细胞培养液为代表的目的蛋白质和杂质的混合液中除去杂质，从而有效地提纯目的蛋白质的方法。

背景技术

近年，生物技术产业中，蛋白质的实用性大量提纯是一个重要的课题。特别是医药领域中，抗体药物方面的需要增长得很快，迫切需要确立一种能够有效大量生产和大量提纯蛋白质的技术。

通常，蛋白质是使用来自动物的细胞株经细胞培养生产的。为了将用作目的的蛋白质(以下有时简称为“目的蛋白质”)、特殊药品的抗体药物实用化，需要从细胞培养液中除去细胞碎片等浊质成分和来自细胞的溶存的蛋白质等非浊质成分，提纯到足以用于人体治疗用途的组成。

由细胞培养液提纯目的蛋白质的常规操作中，首先，对细胞培养液进行离心分离，沉降除去浊质成分。接下来，使用精密过滤膜，通过定径过滤(サイブろ過)，将浊质成分中不能通过离心分离除尽的约1μm以下的细胞碎片除去。进而，为了无菌化，使用最大微孔径为0.22μm以下的过滤膜，实施无菌化过滤，得到目的蛋白质的澄清溶液(收获工序)。得到含有目的蛋白质的澄清溶液后，接着采用以亲和色谱法为首的利用2个以上的层析法技术的组合的提纯工艺来分离提纯目的蛋白质(后处理工序)。由培养液中的细胞产生且在该培养液中溶存的杂质蛋白质在后处理工序被除去。由细胞培养液提纯目的蛋白质等的上述现有方法中，该培养液中的目的蛋白质的浓度通常为1g/L以下，该培养液中所含有的细胞碎片和溶存的杂质蛋白质等的浓度也与目的蛋白质的浓度处于相同的程度。在该浓度范围，利用现有的收获工序和后处理工序的提纯工艺对目的蛋白质的提纯十分有效。

但是，随着抗体药物的需求的急速上升，作为抗体药品的蛋白质面临着大量生产，随着培养技术的快速进步，近年来细胞培养液中的目的蛋白质的浓度增加，要达到了10g/L。该培养技术的快速进步的同时，意味着细胞培养液中的杂质蛋白质也同样增加了，据预测，这将对采用现有的蛋白质提纯工艺进行的提纯增加巨大的负荷。

因此，作为用于蛋白质的大量提纯的技术，例如专利文献1和2公开了一种蛋白质吸附膜，其中，在多孔质膜上引入了离于交换基，赋予了多孔质膜蛋白质吸附能力，并也已经能够购买。

另外，作为蛋白质吸附膜的使用例，专利文献3公开了一种方法，其中，使用2种蛋白质吸附膜(引入了阴离子交换基的纤维素多孔膜和引入了阳离子交换基的纤维素多孔膜)，从淋巴液分离白蛋白。

还有，专利文献4公开了使用引入了阴离子交换基的纤维素多孔膜分离核酸和内毒素的方法。

此外，专利文献5和6分别公开了在聚醚砜多孔膜引入阳离子交换基和阴离子交换基得到的蛋白质吸附膜。

非专利文献1公开了使用含有离子交换基的多孔膜分离核酸和单克隆抗体的方法。

专利文献1：美国专利第5,547,575号说明书

专利文献2：美国专利第5,739,316号说明书

专利文献3：美国专利第6,001,974号说明书

专利文献4：美国专利第6,235,892号说明书

专利文献5：美国专利第6,783,937号说明书

专利文献6：美国专利第6,780,327号说明书

非专利文献1：Bioseparation 8：281-291，1999

发明内容

但是，在将含有高浓度的目的蛋白质的细胞培养液经离心分离、精密过滤、以及无菌化过滤得到清澄液，并将该清澄液用蛋白A亲和柱(亲和色谱柱)选择性吸附目的蛋白质后，利用酸性洗脱液洗脱回收时，回收液中常常含有凝聚的杂质。另外，随着蛋白A亲和柱重复使用的次数增加，该凝聚的杂质的量也增加，同时回收的目的蛋白质的量出现降低的趋势。

如上所述，杂质蛋白质的量越多，亲和层析工序的负荷越大，由于柱的清洗等，提纯工序所需的时间长，不仅如此，用于亲和层析的色谱柱的珠(beads)的寿命、特别是蛋白A亲和柱的寿命也变短了。蛋白A亲和柱的价格高，所以不希望该柱的寿命变短。

另外，专利文献1～4所公开的方法中，将用于分离的原液预先通过精密过滤膜，除去颗粒状的不溶物后实施分离操作。这是因为，所使用的蛋白质吸附膜的最大微孔径较大，为3μm～5μm，该蛋白质吸附膜不能除去颗粒状的不溶物。

专利文献5和6所公开的方法中，蛋白质吸附膜的最大微孔径为0.8μm～1.0μm，也不能除去微细的颗粒状的不溶物。