[发明专利]微生物的快速检测

说明书

技术领域

本文件涉及用于检测微生物的方法和材料。更具体地讲，本文件涉及通过快速富集微生物和使用基于不经扩增的核酸的测试来检测微生物的微生物检测方法。

发明背景

为防止食源性病原体的传播，食物产品的制造商和/或加工者在产品投放给消费者之前要例行测试样品确定是否存在受污染产品。大量病原体的存在会导致食物产品的污染，另外如果被人或动物消费的话会导致食源性疾病。在美国，与消费受污染食物产品有关的食物中毒病例数目据保守估计每年有好几百万例。虽然大多数的细菌性食物中毒人病例仅导致急性症状性疾病(例如恶心、呕吐、腹泻、发冷、发烧和虚脱)，但在婴儿、老人、孕妇和免疫系统受损者中可出现死亡。

检测病原体的典型方法包括：预富集，即在非选择性培养基中对食物样品进行富集，以使受损伤的细菌细胞恢复到稳定的生理状况；选择性富集，即向培养基中加入促生长物质和选择性抑制试剂以促进选定的病原微生物的生长，同时限制大多数其他细菌的增殖；和通过生化测定、免疫测定、聚合酶链反应(PCR)或血清学技术检测任何病原微生物。这些方法要花24-72小时才能完成。

发明内容

本发明公开了用于检测样品中的微生物的快速方法。该方法包括可在用于匀化样品的同一容器中进行的富集步骤。可通过多种方法在富集的样品中检测微生物，包括基于不经扩增的核酸的测试，如杂交保护测定。本文所述的方法可用来在不到18小时内检测食品基质中的低水平病原体。

在一个方面，本发明公开了检测样品(例如食物样品如乳制品、肉、蔬菜或海产食品)中的靶标微生物的方法。该方法包括在容器(例如袋)中匀化样品，其中该容器包含生长培养基；对容器中经匀化的样品进行温育以在样品中存在靶标微生物时对其进行富集；以及对靶标微生物的不经扩增的核酸进行检测。靶标微生物可在包含来自非靶标微生物的核酸的混合物中检测到。靶标微生物选自肠杆菌科(Enterobacteriaceae)和微球菌科(Micrococcaceae)。例如，靶标微生物可选自葡萄球菌属(Staphylococcus)、链球菌属(Streptococcus)、假单胞菌属(Pseudomonas)、肠球菌属(Enterococcus)、沙门氏菌属(Salmonella)、军团菌属(Legionella)、志贺氏菌属(Shigella)、耶尔森氏菌属(Yersinia)、肠杆菌属(Enterobacter)、埃希氏菌属(Escherichia)、芽孢杆菌属(Bacillus)、李斯特氏菌属(Listeria)、梭菌属(Clostridium)、弯曲杆菌属(Campylobacter)、弧菌属(Vibrio)和棒状杆菌属(Corynebacteria)。

检测步骤可包括溶解样品中的微生物；使核酸探针与靶标微生物的靶标核酸序列杂交以形成探针：靶标复合物，其中包含被该复合物稳定化的标记；选择性降解未杂交的探针中存在的标记；以及检测被稳定化的标记的存在或量，作为样品中靶标核酸序列的存在或量的度量。探针可用吖啶鎓酯进行标记。探针可与靶标微生物的核糖体RNA杂交。

生长培养基可包含针对非靶标微生物的生长抑制剂。生长抑制剂可选自胆汁盐、脱氧胆酸钠、亚硒酸钠、硫代硫酸钠、氯化锂、亚碲酸钾、连四硫酸钠、乙酰磺胺钠、扁桃酸、亚硒酸半胱氨酸连四硫酸盐、磺胺二甲嘧啶、亮绿、孔雀石绿、结晶紫、Tergitol4、磺胺嘧啶、阿米卡星、氨曲南、萘啶酮酸、吖啶黄、多粘菌素B、新生霉素和阿拉磷。

温育步骤可在30℃至45℃下进行10至18小时。例如，温育步骤可在35℃至42℃下进行10至18小时。生长培养基可包含能让靶标微生物生长至最低水平10⁴cfu/mL的营养物。生长培养基可包含支持超过一种靶标微生物的生长的营养物。

本发明还涉及用于检测微生物的制品。该制品包括多孔固体基材，其中该固体基材的每个孔用裂解试剂和核酸探针进行包被。在一些实施例中，基材还用选择剂进行包被。该制品还可包括匀化容器，其中该匀化容器包含涂覆在该容器内表面上的生长培养基。该涂覆层可以是干燥的涂覆层。匀化容器还可包含涂覆在容器内表面上的针对非靶标微生物的生长抑制剂。多孔固体基材可以是96孔板、384孔板或微流控样品处理装置。该制品可包括多个多孔基材，其中每个多孔基材专用于不同的微生物。