[发明专利]包含于酸性水溶液中的GDF-5的蛋白质配方

说明书

技术领域

本发明涉及在低温下处理和长时间保存过程中具有改进的稳定性的骨形态发生蛋白液体组合物。更具体地讲，本发明涉及包含于pH为约3.0至约3.6的酸性溶液中的GDF-5、在低温下处理和长时间保存过程中具有改进的蛋白质稳定性的生物相容性液体组合物。

背景技术

GDF-5是骨形态发生蛋白(BMP)的一个成员，BMP是蛋白质的TGF-β超家族的一个亚类。GDF-5包括几种变体(variant)和突变体(mutant)，包括最初由Lee(美国专利No 5,801,014)从小鼠分离得到的mGDF-5在内。其他的变体包括：MP52，为GDF-5的人形式的专利名称(WO95/04819)，GDF-5的人形式也称hGDF-5，亦称LAP-4(Triantfilou等人，Nature Immunology 2，338-345(2001))；还有CDMP-1，为hGDF-5的等位基因蛋白质变体(WO 96/14335)；还有rhGDF-5，为在细菌中产生的重组人形式(EP 0955313)；还有rhGDF-5-Ala83，为rhGDF-5的单聚变体；还有BMP-14，为hGDF-5/CDMP-1样蛋白的统称；还有Radotermin，为世界卫生组织给出的国际非专有名称；还有HMW MP52，为MP52的高分子量蛋白质变体；还有C465A，为其中负责分子间交联的半胱氨酸残基被丙氨酸置换的单聚版本；还有其他的活性单体和单一氨基酸置换突变体，包括N445T、L441P、R438L和R438K在内。出于本申请的目的，术语“GDF-5”意在包括GDF-5蛋白的所有变体和突变体，其中rhGDF-5是具有119个氨基酸的示例性成员。

BMP家族的所有成员共享包括羧基末端活性结构域在内的共同结构特征，和共享高度保守模式的半胱氨酸残基，所述残基产生三个分子内二硫键和一个分子间二硫键。活性形式可为单个家族成员的二硫键键合同型二聚体，或者为两个不同成员的异型二聚体(参见Massague等人，Annual Review of Cell Biology 6：957(1990)；Sampath等人，Journal ofBiological Chemistry 265：13198(1990)；Celeste等人，PNAS 87：9843-47(1990)；美国专利No.5,011,691和美国专利No.5,266,683)。GDF-5蛋白的正确折叠和这些二硫键的形成对于生物机能是必要的，错折叠会导致产生无活性聚集体和切割片断。

从遗传修饰的细菌产生BMP(特别是产生GDF-5)是利用质粒载体来转化大肠杆菌，从而以高收率产生单体GDF-5蛋白(参见例如Hotten的US 6,764,994和Makishima的US 7,235,527)。所述单体从内含体获得，经过纯化，然后再折叠成GDF-5蛋白的同型二聚体，以产生GDF-5蛋白的生物活性二聚体。通向二聚体的各步骤利用到各种药学上不可接受的材料来修饰溶解度，以便能够分离和纯化GDF-5蛋白。

一般蛋白质的降解在文献中已有充分的记述，但是骨形态发生蛋白特别是GDF-5的保存和溶解度未得到充分的记述。当pH在6以下时，BMP-2在大于1mg/ml的浓度下都容易溶解，在pH 6以上时，可通过添加1M NaCl、30％异丙醇或0.1mM肝素提高溶解度(Ruppert等人，EurJ Biochem 237，295-302(1996))。GDF-5在生理pH的范围和缓冲液中几乎不可溶，在极端pH下仅可溶于水(Honda等人，Journal of Bioscienceand Bioengineering 89(6)，582-589(2000))。GDF-5在约9.5至12.0的碱性pH下可溶，但是在这些条件下蛋白质会快速降解，因此使用酸性条件来制备GDF-5蛋白。