[发明专利]改良的用于二硫键形成的方法

说明书

本说明书通篇引用了许多文献。这些文献的公开内容通过引用其整体 在此并入。

技术领域

本发明涉及改良的用于二硫键形成的方法。

发明背景

1985年，Smith首次证实丝状噬菌体耐受外源蛋白质片段插入到它们 的基因III蛋白(pIII)，且能够显示出，该蛋白质片段存在于噬菌体表面 (Smith，1985)。Ladner将这一概念延伸至噬菌体颗粒的表面上展示的(多) 肽库和/或蛋白质库的筛选(WO88/06630；WO90/02809)。自此，噬菌体 展示经历了显著地进步，并获得大量的成果。

已开发了多种形式以构建和筛选(多)肽/蛋白质噬菌体展示文库，并 且许多综述型文章和专论涵盖并总结了这些发展(例如Kay等人，1996； Dunn，1996；McGregor，1996)。最常见地是，已经使用基于丝状噬菌体的 系统。

最初提供为单链Fv(scFv)片段的展示(WO88/06630；还参见WO 92/01047)，该方法已经迅速延伸至其他(多)肽/蛋白质的展示，包括诸 如Fab片段(WO91/17271；WO92/01047)的多亚基蛋白的展示，所述 其他(多)肽/蛋白质诸如牛胰胰蛋白酶抑制剂(BPTI)(WO90/02809)、 肽文库(WO91/19818)、人类生长激素(WO92/09690)和多种其他蛋白 质。

为了将(多)肽/蛋白质锚定于丝状噬菌体表面，主要使用噬菌体的外 壳蛋白的基因融合物。优选的是与基因III蛋白(Parmley&Smith，1988) 或其片段(Bass等人，1990)，以及基因VIII蛋白(Greenwood等人，1991) 的融合物。在一种情况下，使用了基因VI(Jespers等人，1995)，且在一种 情况下，已将基因VII和基因IX的组合用于Fv片段的展示(Gao等人， 1999)。

此外，还在噬菌体λ上实现噬菌体展示。在此情况下，使用了基因V 蛋白(Maruyama等人，1994)、基因J蛋白和基因D蛋白(Sternberg&Hoess， 1995；Mikawa等人，1996)。

除了使用基因融合物之外，外源肽或蛋白质已经由相关结构域连接于 噬菌体表面。在WO91/17271中，其建议使用噬菌体上展示的标签和融合 于待展示的(多)肽/蛋白质的标签结合的配体以实现非共价展示。

实行类似的概念用于cDNA文库的展示(Crameri&Suter，1993)。其 中，jun/fos相互作用用于调节cDNA片段的展示。在它们的构建体中，位 于jun以及fos的全部末端的侧翼的额外半胱氨酸残基通过形成两个二硫 键而进一步稳定该相互作用。

过去，一个问题是如何最佳地恢复已经结合于所需靶的噬菌体。通常， 这是通过用合适的缓冲液洗脱，无论通过使用pH或盐梯度，或通过使用 可溶的靶的特定洗脱来实现。然而，以高亲和力结合于靶的最感兴趣的结 合子通过该方法可能脱去。已描述了几种可选的方法，其试图克服该问题， 其通过在所展示的(多)肽/蛋白质和其融合配偶体之间，或在感兴趣的靶 和将该靶锚定于固体表面的它的载体之间提供切割信号。此外，上文涉及 的方法中的大多数需要使用包括至少部分的噬菌体外壳蛋白和外源(多) 肽/蛋白质的融合蛋白。

在WO01/05909中，描述了完全不同的系统，其不需要融合蛋白，且 因此解决了这些问题中的许多问题。描述于WO01/05909的称为 “CysDisplay”的系统是基于噬菌体外壳蛋白和免疫球蛋白或其功能片段 之间的共价二硫键的形成。免疫球蛋白或其功能片段展示于噬菌体颗粒的 表面上。随后，在WO03/060065中公开了相似的技术。WO03/060065不 同于WO01/05909的是，加Cys标签的pIII多肽是经改良的辅助噬菌体而 非噬菌粒来提供。此外，WO03/060065还提到了可用于在噬菌体颗粒上展 示(多)肽/蛋白质的其他适配子，诸如同源多亚基蛋白(PDGF、Max、 ReIA、神经营养蛋白)和异源多亚基蛋白(蛋白质k激酶复合体、含SH2- 结构域的蛋白质(SH2-domainconatingprotein)、aPaI/Max、Hox/Pbx)。