[发明专利]双组分基因组黄病毒及其应用

说明书

发明背景

发明领域

本发明涉及分子生物学、病毒学和免疫学领域。更具体地讲，本发明提供复制缺陷黄病毒并公开了其作为针对黄病毒相关疾病的疫苗的用途。

相关领域的描述

黄病毒科(Flaviviridae)的黄病毒属(Flavivirus)包含了多种重要的人和动物病原体，包括黄热病病毒、蜱传脑炎病毒、日本脑炎病毒、登革热病毒、西尼罗河病毒、典型猪瘟病毒、牛病毒性腹泻病毒和丙型肝炎病毒。在自然界中，黄病毒在脊椎动物宿主与主要以大量蚊和蜱为代表的各种节肢动物媒介之间循环。该属的近40个成员，分属4个不同抗原复合群(antigenic complex)，都能引起人类疾病。

黄病毒基因组是约12kb的阳性极性单链RNA。它编码单个多肽，所述单个多肽在翻译时或翻译后由细胞蛋白酶和病毒蛋白酶加工为病毒结构蛋白，C、prM/M和E，其形成感染性病毒颗粒；以及非结构蛋白，NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B和NS5，其形成病毒基因组复制所需的酶复合物(Lindenbach和Rice，2001)。黄病毒基因组因具有5′甲基鸟苷酸帽子而模拟细胞信使RNA的结构，但又因缺乏3′-端聚(A)序列而不同于细胞RNA模板。

在黄病毒病毒体中，单拷贝病毒基因组RNA被C(衣壳)蛋白包装为核壳，被具有M和E蛋白的嵌入二聚体的脂质被膜包围。尚未完全理解核壳与被膜间相互作用机制，但是看来与例如甲病毒核壳-被膜相互作用相比具有更低特异性，并且来自隶属不同抗原复合群的病毒的衣壳蛋白和被膜蛋白可有效形成黄病毒病毒体(Chambers等，1999；Lorenz等，2002；Monath等，2002)。此外，核壳的存在并非颗粒装配绝对必需的，而且可通过从各种各样载体中仅表达prM和E来达到病毒样颗粒的形成和从细胞中释放出来。这些所谓的亚病毒颗粒(SVP)不含RNA或衣壳蛋白(Mason等，1991)，但具有组成二十面体的含脂质结构的被膜蛋白。含有prM/E的亚病毒颗粒能够诱导有效的免疫应答，从而保护动物以免此后感染具有复制能力的病毒(Konishi和Fujii，2002；Konishi，Fujii和Mason，2001；Konishi等，1992；Qiao等，2004)，DNA(Aberle等，1999；Colombage等，1998；Davis等，2001；Kochel等，1997；Kochel等，2000；Konishi等，2000a；Konishi等，2000b；Phillpotts，Venugopal和Brooks，1996；Schmaljohn等，1997)。由于缺乏核壳包装的复制型RNA，使亚病毒颗粒作为潜在疫苗的应用非常有利，但需要开发新手段，用于大规模生产或递送表达构建体。可根据病毒载体和非病毒载体来设计prM/E表达盒。就病毒载体而言，经常要考虑的是针对所用病毒载体的免疫应答或者是发展而来的、或者是先前已有的。在基于RNA聚合酶II启动子的有效控制之下编码这些基因的基于DNA的盒，看来是优先的。然而，它们在临床实践中的应用仍然有疑问。因此，目前仍然主要还是通过使用灭活疫苗或减毒活疫苗(分别为INV和LAV)来完成针对黄病毒的免疫接种。

近期研究表明，黄病毒结构蛋白对RNA基因组复制而言并非必要。它们可以是完整的，也可以是部分缺失的，并且这样的RNA(复制子)仍可自我复制并且不仅能表达非结构基因、而且还能表达其余结构基因和/或额外的异源基因。例如，可在体外合成缺乏功能性衣壳基因、但具有其它完整结构基因的黄病毒基因组并直接用于免疫接种。它们的复制导致亚病毒颗粒的产生并最终诱导保护性免疫应答。不能引起生产性传播感染的修饰黄病毒的应用是设计安全有效地生产保护性免疫疫苗的一种新手段(Aberle等，2005；Kofler等，2004)。然而，其应用很可能还需要改进将体外合成的RNA递送到允许RNA复制的细胞中的递送方法。这可通过采用完全自然的方式而达到：即通过将这些缺陷基因组包装到由病毒结构蛋白组成的感染性颗粒中。