[发明专利]利用差异化衍生质谱法检测异构体

说明书

相关申请的交叉引用

本申请要求2007年5月4日提交的美国申请11/744518的优先权，在此引入其全部内容作为参考。

发明背景

质谱法是一种用于分析离子质荷比的方法。可利用该方法通过生成指示分析物组分的质谱提供具体分析物的组成(串联质谱法(tandem massspectrometry))。该方法的一些应用包括筛查生物样品的特殊紊乱或疾病的标记。

发明内容

质谱法(MS)可用于评价支链氨基酸并可用于辨别支链氨基酸分子异构体，例如亮氨酸、异亮氨酸和别异亮氨酸。检测异构的支链氨基酸的方法可包括使样品衍生，例如使样品酯化。然而，这些氨基酸通常以不同的效率衍生。

不同的衍生效率可用于改善各种支链氨基酸的检测特异性和/或灵敏性。内标物例如用一个或多个重同位素标记的支链氨基酸可用于追踪衍生效率，从而强化对样品中的支链氨基酸的检测和量化。在一些情况下，使用至少两种内标物。所述标准物与支链氨基酸同分异构，但由于具有不同的重同位素标记而具有互不相同的分子量。在一些实施方案中，在衍生之前加入一种内标物，在衍生之后加入另一种内标物。在一些实施方案中，一种标准物相应于衍生的氨基酸，另一种标准物相应于未衍生的氨基酸。

一方面，提供评价支链氨基酸的分子异构体例如亮氨酸、异亮氨酸和别异亮氨酸的方法。该方法包括使样品中的支链氨基酸的一种或多种分子异构体衍生，所述样品包含用一个或多个重原子标记作为第一标准物的支链氨基酸。第一标准物例如可以是亮氨酸、异亮氨酸和别异亮氨酸。在衍生之后，将用一个或多个重原子标记作为第二标准物的未衍生或衍生支链氨基酸加入到样品中。第二标准物例如可以是亮氨酸、异亮氨酸和别异亮氨酸。利用串联质谱法评价样品，并检测指示样品中一种或多种支链氨基酸(例如亮氨酸、异亮氨酸和别异亮氨酸)的衍生和未衍生形式(例如丁基化和未丁基化形式)的峰。

第一和第二标准物的衍生形式由于不同的重原子标记可具有不同的分子量。第一和第二标准物的未衍生形式由于不同的重原子标记可具有不同的分子量。

该方法还可包括通过参照第一和第二标准物确定支链氨基酸的衍生效率。该方法还可包括利用衍生效率确定样品中的支链氨基酸的浓度。

衍生可以是酯化，例如使用醇(如丁醇、异丙醇、乙醇和甲醇)进行的酯化。酯化步骤可包括调整一个或多个参数例如温度和保温时间(incubationtime)，以降低异亮氨酸和别异亮氨酸之一或异亮氨酸和别异亮氨酸两者的酯化程度。可使小于100％的支链氨基酸衍生例如酯化，例如可使约80-94％的亮氨酸酯化，可使约5-20％的异亮氨酸酯化，以及可使约25-40％的别异亮氨酸酯化。

在衍生之前样品还可包括第三和/或第四标准物。第三和/或第四标准物例如可以是亮氨酸、异亮氨酸和别异亮氨酸。第一、第二、第三和(任选的)第四标准物的衍生形式由于不同的重原子标记可具有不同的分子量。第一、第二、第三和(任选的)第四标准物的未衍生形式由于不同的重原子标记可具有不同的分子量。该方法可包括本文所述的其它特征。

另一方面，提供诊断代谢紊乱的方法。该方法包括在使样品中的支链氨基酸(例如亮氨酸、异亮氨酸和别异亮氨酸)衍生的条件下处理源自受验者的样品，例如包括血液的样品。受验者可以是人，例如新生儿。样品包括用一个或多个重原子标记作为第一标准物的支链氨基酸，例如亮氨酸、异亮氨酸和别异亮氨酸。在衍生之后，加入用一个或多个重原子标记作为第二标准物的未衍生或衍生支链氨基酸，例如亮氨酸、异亮氨酸和别异亮氨酸。利用串联质谱法评价样品，并检测指示样品中一种或多种支链氨基酸(例如亮氨酸、异亮氨酸和别异亮氨酸)的衍生和未衍生形式(例如丁基化和未丁基化形式)的峰。相对于一种或多种参照样品中的水平，该样品中一种或多种支链氨基酸的改变水平(altered level)是受验者具有产生代谢紊乱的风险或正处于产生代谢紊乱的风险之中的指示，代谢紊乱由支链氨基酸和支链酮酸之一或支链氨基酸和支链酮酸两者的改变水平表征。

代谢紊乱例如可以是槭糖尿紊乱(MSUD)，例如典型MSUD、中度MSUD、间歇性MSUD、硫胺敏感型MSUD和/或E3不足型MSUD。紊乱可通过下述中的一种或多种进一步表征：酮酸中毒、神经异常和发育障碍。

该方法还可包括通过参照第一和第二标准物确定支链氨基酸的衍生效率。该方法还可包括利用衍生效率确定样品中的支链氨基酸的浓度。