[发明专利]生产促卵泡激素的细胞克隆

说明书

本发明涉及含有分别编码人促卵泡激素(FSH)的α链和β链的核酸序 列的核酸分子，同野生型的人促卵泡激素相比，对核酸序列在CHO细胞中 的密码子使用进行了修饰。

本发明还涉及含有这样的核酸序列的重组核酸分子、内含这样的重组 核酸分子的宿主细胞，以及它们在人促卵泡激素的生产中的用途。

最后本发明也涉及了在无血清的情况下将本发明的重组核酸分子转染 入悬浮培养的细胞，从而制造出表达人促卵泡激素的宿主细胞的方法。

促卵泡激素是由垂体前叶的促性腺细胞制造并释放到循环系统。促卵 泡激素与黄体生成素(LH)一起作用控制女性卵母细胞的成熟和男性精子 的产生。促卵泡激素和黄体生成素都属于异二聚体糖蛋白家族，其由独立 的基因分别编码的两条非共价连接的α链和β链形成。FSH和LH的α链的 氨基酸序列是相同的，但β链的氨基酸序列是不同的。α链和β链都是糖 基化的。促卵泡激素的α链的两个潜在的天冬氨酰胺连接的糖基化位点， 分别在52和78的位置，而β链的两个潜在的天冬氨酰胺连接的糖基化位 点则分别在7和24的位置(Olijve等(1996)Mol.Hum.Reprod. 2(5)：371-382)。

人促卵泡激素用来治疗不孕(unovulation)的女性，刺激多卵泡发育 (超数排卵)和用于辅助受孕的制剂，如IVF，GIFT或ZIFT。而且人促卵 泡激素用来刺激患有低水平或者缺乏促卵泡激素的产生的女性的卵泡成 熟、和刺激先天或者后天性患有低促性腺素性功能减退症的男性的精子发 生。

最初医学使用的促卵泡激素是从人绝经期后的尿液中提纯的。但是这 种提纯的促卵泡激素有缺陷，内有黄体生成素和其它人源蛋白的污染。而 且这种天然来源的使用暗示了有限的产品可用性和一致性。

随着DNA重组技术的出现，使得通过将编码α链和β链的核酸序列转 染入培养细胞来生产人促卵泡激素成为可能。编码α链和β链的DNA序列 和生产重组的人促卵泡激素的方法已经公开，比如在WO 88/10270，WO 86/04589和EP 0 735 139中。

目前德国市场上有两种市售的重组人促卵泡激素产品，即和 它们都是通过在CHO细胞中表达编码野生的α链和β链的DNA 来生产的。

但是仍旧需要优化促卵泡激素链的表达从而对一定数目的细胞而言， 提高促卵泡激素的产量和表达率。因此本发明要解决的一个问题就是提供 核酸序列和重组核酸分子，使得重组人促卵泡激素能够在真核细胞中大量 产生。

根据本发明，这样的及另外的问题都已由独立权利要求的特征解决。

有利方案在从属权利要求中定义。

根据本发明，含有修饰的编码人促卵泡激素的α链和β链的核酸序列 的核酸分子经修改已适应中华仓鼠卵巢(CHO)细胞的密码子使用，该核酸 分子用于转染CHO细胞后引起了促卵泡激素在转染的CHO细胞中的产量显 著性增加。

在本发明的上下文中，术语“促卵泡激素产量增加”指的是这样的情 况，一旦把修饰的核酸序列表达在宿主细胞中，与把有同样的氨基酸序列 的非修饰的编码促卵泡激素的核酸序列在相似的条件下(比如具有可比较 的转染过程和可比较的表达载体等等)表达在同一类型的宿主细胞中相比， 有更高产量的促卵泡激素在宿主细胞中产生。

遗传密码是冗余的，20个氨基酸由61个三联体密码子编码。因此， 这20个蛋白质氨基酸中的大多数是由几种碱基三联体(密码子)编码的。 编码某一特定的氨基酸的密码子在某一特定的生物体内的使用频率并不相 同，但是有使用频繁的偏爱密码子和较少使用的稀有密码子。人们认为所 述密码子使用不同来自选择性的进化压力，尤其是翻译效率。稀有密码子 的翻译效率低的原因可能是相对应的氨酰tRNA的库被清空，不再能用来合 成蛋白质。

而且不同的生物体偏爱不同的密码子。于是，例如源于哺乳动物细胞 的重组DNA在大肠杆菌细胞中的表达往往达不到最佳状态。因此把稀有密 码子替换为高频使用的密码子在一些情况下能增强表达。