[发明专利]对于有机介质中的亲水性底物具有高耐受性的改性的固定化酶

说明书

技术领域

本发明涉及对于醇、尤其是短链醇和其它亲水物质具有改善的活性 和稳定性的固定化界面酶，特别是脂肪酶和磷脂酶，及其它水解酶。本 发明还涉及制备这些酶的方法和这些酶的各种工业应用及研究应用，特 别是在制造通常用作生物柴油的如甲酯等脂肪酸短链烷基酯中的应用。

背景技术

界面酶是一类在它们的蛋白结构中包含两个区的酶；第一个区是亲 水区，而第二个区是疏水区。这个独特的特征使得这一类酶一旦存在于 两相体系中时就会偏好界面区域。在这些条件下，形成了活性构象，其 中酶分子的亲水区朝向水层而疏水区朝向疏水层。

脂肪酶和磷脂酶是最常见的界面酶，其一旦存在于界面体系中就表 达其催化活性。脂肪酶(甘油三酯水解酶E.C.3.1.1.3)被定义为作用于水性 体系中的甘油三酯的酯键以产生游离脂肪酸、偏甘油酯和甘油的水解酶。 磷脂酶也属于水解酶类，然而它们有利地且特异性地切断存在于水性体 系中的磷脂的酯键，从而根据磷脂酶的类型而产生游离脂肪酸、溶血磷 脂、甘油磷酯、磷脂酸和游离醇。

脂肪酶和磷脂酶广泛分布于动物、植物和微生物中。过去二十年间 对脂肪酶和磷脂酶的工业应用的兴趣一直快速增长。已经发现在低的水 活性下这类酶催化它们的逆水解反应。脂肪酶和磷脂酶的逆催化活性已 经被广泛用于含酯键和酰胺键的有价值的化合物或含有如羟基、羧基和 氨基等官能团的其它相关化学物质的合成。具体而言，脂肪酶和磷脂酶 已经被用于重整脂肪、油、蜡、磷脂和鞘脂以获得新的期望的功能性质， 还用于将光学活性的化合物从它们的外消旋混合物中分离出来。特别有 意义的是本文所公开的界面酶在短链烷基酯(生物柴油)的合成中的应用。

目前，超过40种的不同脂肪酶和磷脂酶可商购获得，然而其中仅有 少数是以商业化量制备的。一些最有工业前景的界面酶源自由南极假丝 酵母(Candida antarctica)、皱褶假丝酵母(Candida rugosa)、米黑根毛霉 (Rhizomucor miehei)、假单胞菌(Pseudomonas sp.)、雪白根霉(Rhizopus niveus)、爪哇毛霉(Mucor javanicus)、米根霉(Rhizopus oryzae)、黑曲霉 (Aspergillus niger)、卡门柏青霉(Penicillium camembertii)、产碱杆菌 (Alcaligenes sp.)、伯克霍尔德氏菌(Burkholderia sp.)、疏绵状嗜热丝孢菌 (Thermomyces lanuginosa)、粘稠色杆菌(Chromobacterium viscosum)、木瓜 籽和胰酶。

酶的固定化已经被大量技术所说明，这些技术基本上针对降低在整 个方法中酶所占的成本、帮助从产物中回收酶和使得方法能够连续运行。 固定化技术通常根据如下条件划分：

1.酶在如二氧化硅和不溶性聚合物等固体载体上的物理吸附。

2.酶在离子交换树脂上的吸附。

3.酶与如环氧化无机载体或环氧化聚合物载体等固体载体材料的 共价结合。

4.酶在增长中的聚合物内的包埋。

5.酶在膜反应器或半渗透性凝胶中的封闭。

6.交联酶晶体(CLECS)或交联酶聚集体(CLEAS)。

所有上述的酶固定化程序都包括下列步骤：

1.将酶溶解在对于pH、温度、缓冲盐类型和离子强度而言适当的缓 冲体系中。

2.将固体载体加入到酶溶液中并混合一段时间，直至酶分子被固定 在固体载体上。

3.过滤出含有固定化酶的固体载体。

4.以适当缓冲剂洗涤所述载体以除去松散结合的酶分子，然后干燥 所述固体载体。

界面酶，主要是脂肪酶，已经按照上述技术而被固定化。这些技术 提供了拥有较低的合成活性和/或较短的工作半衰期的固定化酶制品。为 了试图增加固定化的脂肪酶和其它界面酶的合成活性，已应用了各种激 活方法。这些方法包括：

1.将酶的表面官能团与如脂肪酸或聚乙二醇等疏水性残基结合。

2.用如多元醇脂肪酸酯等表面活性剂被覆酶表面。

3.将酶与疏水性载体接触，所述疏水性载体通常为聚丙烯并且已经 用如乙醇或异丙醇等亲水溶剂预处理过。