[发明专利]用于病毒增殖的两阶段温度分布

说明书

本申请要求申请日为2007年5月4日的美国临时专利申请No.60/927,693的优先权，现将其全部内容并入本文作为参考。

技术领域

[0001]本发明涉及病毒增殖领域。

背景技术

[0002]在动物细胞培养基中的病毒增殖是在取决于病毒和用于增殖的宿主体系的特性的温度条件下进行的。选择特定的温度用于细胞的生长(在细胞培养基或者胚卵的繁殖中)，接着选定温度用于病毒的增殖。在大多数情况下，病毒增殖温度低于细胞增殖温度。对温度敏感的病毒增殖涉及到在大约围绕用于昆虫细胞培养(随着例如杆状病毒产生)的20℃的温度范围内、以及在用于哺乳动物细胞培养中的病毒制备的直至约37℃的温度下影响病毒增殖速度和抗原形成，使用对于每种病毒/寄主细胞组合的特定的最适条件。更高的温度会影响感染动力学和病毒的稳定性。当病毒在37℃温度下增殖时，在后续的病毒复制期间会经常观察到降低的病毒滴度和更低的病毒抗原质量。这种影响对于用于疫苗生产的大规模病毒增殖可能具有不利的后果。

[0003]本发明的目标在于提供改善的生长条件，其不会影响生产的用于疫苗目的的抗原质量。

发明内容

[0004]本发明提供了一种用于病毒生产的方法，其中，一种以上寄主细胞被病毒感染，然后在第一温度下培养(例如，在31℃至37℃的温度下培养1至48小时)；并且随后在第二温度下培养，该第二温度比第一温度低(例如，低1至6℃)。然后收集这些培养步骤中所产生的病毒。

[0005]现在令人惊讶地发现，对于许多病毒包括流感(正粘病毒)、罗斯河病毒(Alphaviridae)和西尼罗河病毒(黄病毒)，培养条件可以通过使用两阶段温度分布而被实质性地改进。更高的温度被应用于病毒增殖的第一阶段，其可促进传染性病毒颗粒的形成。在第二阶段，采用较低的温度，以便维持在更高温度的增殖期间中获得的初始高滴度，并且允许稳定的抗原的形成，该抗原可以被进一步用于免疫原性疫苗的生产。

附图说明

[0006]图1：在Vero细胞中于(A)32℃和(B)36℃下增殖的新喀里多尼亚(NewCaledonia)病毒的抗原显带图形。

[0007]图2：在感染以后在37℃下不同时间点罗斯河病毒(Ross River Virus，RRV)感染的NaBr曲线图。

[0008]图3：在感染以后在35℃下不同时间点罗斯河病毒感染的NaBr曲线图。

[0009]图4：在感染之后在32℃下不同时间点的罗斯河病毒感染的NaBr曲线图。

[0010]图5：在感染之后在35℃/32℃下不同时间点的罗斯河病毒感染的NaBr曲线图。

[0011]图6：在37℃和35℃/32℃下感染的罗斯河病毒接种物的Western blot。

[0012]图7：在感染之后在35℃下不同时间点的西尼罗河病毒感染的NaBr曲线图，同时附有显微图像。

[0013]图8：在感染之后在32℃下不同时间点的西尼罗河病毒感染的NaBr曲线图，同时附有显微图像。

[0014]图9：在感染之后在35℃/32℃下不同时间点的西尼罗河病毒感染的NaBr曲线图，同时附有显微图像。

具体实施方式

[0015]本发明的一个方面是实现允许独立优化和控制下述条件的在此描述的两阶段温度分布：(1)用于寄主细胞多周期感染的活性病毒的形成；(2)在后续的复制阶段中获得高滴度的维持；以及(3)在后续的生产工艺阶段中的抗原形成。

[0016]在本发明的一种优选实施方式中，所述病毒是正粘病毒、α-病毒或黄病毒。