[发明专利]稳定的重组腺苷脱氨酶

说明书

相关申请的交叉引用 

本申请要求2007年4月20日提交的美国临时专利申请序列号60/913,009的优先权，其内容在此引入作为参考。 

技术领域

本发明提供突变以增强稳定性的重组腺苷脱氨酶。 

背景技术

一段时间以来腺苷脱氨酶(ADA)已用于治疗酶缺陷疾病，该疾病称为重症联合免疫缺陷疾病(SCID)或″泡泡男孩(Bubble boy)″疾病。超过15年以前，Enzon Pharmaceuticals已制备治疗性ADA，其以使用牛源ADA酶制备的PEG化的ADA的形式给予患者。 

最近，正尝试使用重组体来源的酶(recombinant source enzyme)(下文称″rADA″)代替牛来源酶。重组人(″rhADA″)和重组牛(″rbADA″)都被考虑作为纯化的天然牛ADA的代替品。该rbADA和rhADA酶相比目前使用的天然纯化的牛的酶有些不稳定。认为rhADA和rbADA以与半胱氨酸降解一致的方式降解：添加氧；二硫醇的形成；随着pH增加降解增加；沉淀，尤其当pH增加且样品浓缩时。在还原的状态(reduced state)，半胱氨酸包含反应性-SH基(巯基)，其为易于降解的形式。 

有证据表明单一的、暴露的半胱氨酸可能是对于rbADA和rhADA两者所观察到的降解的原因。牛ADA(即，从牛来源纯化的天然牛ADA)具有与rhADA非常相似的结构：牛ADA和rhADA在基本序列的相同位置都具有相同数量的半胱氨酸。目前获得的重组人和重组牛ADA包含降解剂(degradants)/杂质(二硫醇)，其与半胱氨酸反应性一致。天然牛ADA在结构上不同于重组牛ADA，因为天然牛ADA具有单摩尔的半胱氨酸与每摩尔ADA键合。天然牛ADA也对高pH稳定，表明与ADA键合的半胱氨酸的功能为保护基。 

一个稳定重组人和/或重组牛ADA的方法是用氧化的谷胱甘肽，碘乙酰胺，碘乙酸，胱氨酸，其它二硫醇中的任一种及其混合物封端该活性Cys残基(成熟rbADA和成熟rhADA两者的Cys 74)。该方法在共同拥有的美国专利申请序列号11/738,012中阐述，名称为，″Stabilized Proteins″，其内容以其整体在此引入作为参考。 

尽管上述说法，但有利地是避免需要另外的通过修饰蛋白质结构而进行的封端步骤，从而提供在表达后立即具有的固有稳定性。美国专利号5,346,823描述了通过突变而进行的原核蛋白酶如枯草杆菌蛋白酶和中性蛋白酶的稳定化，其使用Ser和其它氨基酸残基代替去稳定Cys残基。然而，ADA中活性位点的突变分析显示替换Cys残基(Cys 262)导致具有活性显著降低的酶，Bhaumik等人1993，The J.of Biol Chem，268.(8)：5464-5470。因此，在本发明之前，并不知道通过用另一氨基酸残基代替活性的和暴露的Cys残基而稳定腺苷脱氨酶，同时保持最佳的可用酶活性。 

因此，有利地是提供稳定的rbADA和rhADA，即，在储存过程和对酶最佳PEG化有用的pH水平下的加工过程中没有明显降解。 

发明内容

因此，本发明提供重组ADA，相对于野生型ADA酶，其任何可氧化的半胱氨酸残基被不可氧化的(non-oxidizable)氨基酸残基代替。该突变蛋白ADA包含不可氧化的氨基酸残基，其为天然存在的L-氨基酸中的一种，例如，丙氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、苯丙氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、赖氨酸、亮氨酸、蛋氨酸、天冬酰胺、脯氨酸、谷氨酰胺、精氨酸、丝氨酸、苏氨酸、缬氨酸、色氨酸、酪氨酸和/或现有技术已知的天然存在的L-氨基酸的变体和衍生物，例如，2-氨基己二酸、3-氨基己二酸、β-丙氨酸、β-氨基丙酸、2-氨基丁酸、4-氨基丁酸、哌啶酸、6-氨基己酸、2-氨基庚酸、2-氨基异丁酸、3-氨基异丁酸、2-氨基庚二酸、2，4-二氨基丁酸、锁链素、2，2’-二氨基庚二酸、2，3-二氨基丙酸、N-乙基甘氨酸、N-乙基天冬酰胺、羟基赖氨酸、别羟基赖氨酸、3-羟基脯氨酸、4-羟基脯氨酸、异锁链素、别异亮氨酸、N-甲基甘氨酸、肌氨酸、N-甲基异亮氨酸、6-N-甲基赖氨酸、N-甲基缬氨酸、正缬氨酸、正亮氨酸和鸟氨酸等。任选地，避免蛋氨酸或色氨酸，因为这些是潜在可氧化的。