[发明专利]检测感染的多元方法

说明书

本发明涉及用于体外检测感染性微生物、特别是病毒感染的方法。本发明涉及同时检测针对该相同感染性微生物的总免疫球蛋白和免疫球蛋白M的方法。更具体来说，本发明涉及同时检测针对人类肝炎病毒的总免疫球蛋白和免疫球蛋白M的方法。

总的来说，由人体内微生物、特别是病毒例如肝炎病毒引起的感染，构成了引人注目的健康问题，这个问题长期以来已经被意识到了，特别是在输血和诊断中。

一般来说，为了阻止感染因子、特别是肝炎病毒不受控制的蔓延，重要的是尽可能早地确定来自患者或输血用血袋的样品是否被这样的因子或病毒污染。此外，同样重要的是能够在感染的整个过程中跟踪患者的免疫状态，以便确定患者是否已进入恢复期，从而当后者发生时使用适合的治疗步骤和/或免疫接种。

用于体外检测这种类型的感染的方法，最通常是基于通过针对感染因子的抗体的免疫分析(或定量免疫测定)进行的检测。免疫球蛋白M(“IgMs”)出现得较早并且短暂，是最近的急性、或原发感染的标志。总免疫球蛋白，将各种免疫球蛋白同种型(IgM、IgG和IgA)聚集在一起，是慢性感染或感染持续时间、或患者的恢复期的标志。在急性感染后相当长的时间内，总免疫球蛋白主要由IgG构成，用于支持长期免疫(Hollinger等，Fields Virology，p.735-785，1996)。因此，重要的是能够在整个感染过程中在患者中区分IgMs和总免疫球蛋白。这在体外血清学中是非常普遍的情况。

具体来说，这种类型的问题发现在由肝炎病毒引起的人类感染病例中：甲型肝炎病毒感染被称为HAV；乙型肝炎病毒感染被称为HBV，等等。类似的情况也发现在人类的其它血液病毒的情况：HSV(单纯性疱疹病毒)，CMV(细胞肥大病毒)，登革热病毒，其它黄病毒(例如西尼罗病毒)，风疹病毒，流感病毒，VZV(水痘带状疱疹病毒)等，各种不同细菌的情况(梅毒密螺旋体(Treponema pallidum)、博氏疏螺旋体(Borrelia burgdorferi)等)，以及各种单细胞寄生生物中(例如刚地弓形虫(Toxoplasma gondii))。

通过间接形式(将样品在带有靶抗原的固相上反应，然后通过标记的抗人类免疫球蛋白抗体观察)检测总免疫球蛋白，已经被了解许多年了，尤其是随着1970年代开创性的ELISA专利。但是，这种形式不是优选的，因为它易受非特异性干扰的影响，尤其是受可能存在于被测试样品中的类风湿因子的影响。

此外，FX Heinz等的“用于在血清和脑脊液中检测蜱媒脑炎病毒的两种不同酶免疫分析方法的比较”(″Comparison of two differentenzyme immunoassays for detection of tick-borne encephalitis virus inserum and cerebrospinal fluid″(Journal of Clinical Microbiology，14：p.141-146，(1981))中提到，在用于检测IgM的间接EIA分析(免疫酶法分析)中，存在IgMs与IgGs之间的竞争，影响了最终检测的灵敏性和特异性。

通过“双抗原夹心(double antigen sandwich)”形式检测总免疫球蛋白(将待检测的带有免疫球蛋白的样品与带有抗原的固相进行反应，然后使用被可检测地标记的第二抗原观察)，自从1978年就已经知道(Maiolini等，Journal of Immunological Methods，20(1978)p.25-34；还有公开的法国专利申请FR 2383446)。

通过“免疫球蛋白捕获”形式检测类型特异性免疫球蛋白，其本身也已被知道许多年了。它在1979年由Duermeyer W.等(Journal ofMedical Virology4(1979)：p.25-32)描述，用于通过ELISA特异性检测抗HAV IgMs(也参见美国专利4,292,403)。该分析方法的原理是基于使用包被有抗人类IgM抗体的微板孔，向其中加入含有待检测IgMs的血样。在温育期后，洗涤微板的孔，加入已知量的HAV抗原，然后温育。最后，在进一步洗涤后，通过在存在针对HAV抗原并用酶标记的抗体(F(ab’)₂)的情况下进行最后的温育，检测了任何与孔结合的抗原。美国专利4,273,756以同样的方式描述了类型特异性的“免疫球蛋白捕获”形式，用于检测针对各种不同肝炎病毒(HAV，HBV)的IgAs、IgDs、IgEs、IgGs和IgMs。