[发明专利]已溶血的全血样品中待分析物的检测

说明书

本发明涉及在已溶血的全血样品中待分析物的检测方法，所述方法包括将已知或者疑似含有令人感兴趣的待分析物的已溶血的全血样品施加于到含有限进色谱材料(restricted access chromatography material(RAM))的柱子，从而结合所述待分析物，将所述待分析物从所述RAM上洗脱并检测所述待分析物，其中，至少在第一步中使用pH高于8.0的缓冲液。所述新方法确保了血红蛋白不干扰令人感兴趣的待分析物的检测。所述方法可容易地应用于例如来自已溶血的全血样品的许多待分析物的在线检测中，例如应用于抗生素、叶酸或诸如他克莫司(tacrolimus)或西罗莫司(sirolimus)等免疫抑制药物的检测。

背景技术

样品中成份越多，其中所包含的目标待分析物的分析越困难。红血细胞含有非常大量的蛋白质和小分子量成份，它们对诸如全血等生物流体中令人感兴趣的待分析物的检测可能具有潜在的干扰。这是为什么在临床常规中分别使用血液血浆或简称为血浆(即抗凝全血样品；除去细胞和红细胞)或血液血清或简称为血清(即凝结全血；除去细胞、红细胞凝结体系中的大部分蛋白尤其是纤维蛋白/纤维蛋白原)的主要原因之一。例如与血清或血浆相比，全血样品液更难以处理。全血趋于更不稳定，并且红细胞的缓慢破裂将破坏相当数量的令人感兴趣的待分析物的可靠测量。

如上所述，可以由全血获得血清或血浆并用于待分析物的检测。理论上可以通过过滤或离心从全血中除去细胞和红细胞。然而，这些方法要么不适用于常规诊断环境设置，要么它们不能进行至少部分存在于红血细胞中的那些待分析物的正确测量。

在本领域中广泛已知的用于全血样品中待分析物的检测的绝大多数方法都要求在待分析物能够被量化之前对样品进一步的处理。在许多方法中，首先通过选择性沉淀或萃取方法从潜在干扰性物质中分离令人感兴趣的待分析物。萃取可在液相中或固相上进行。通过分别描述在一些免疫抑制药物或叶酸的检测中使用的方法能对此进行举例说明。

广泛已知的免疫抑制药物例如有霉酚酸酯(mycophenolate mofetil)(MMF)、纳巴霉素(rapamycin)(RAPA，也称为西罗莫司(sirolimus))和他克莫司(tacrolimus)(FK-506)。免疫抑制药物的治疗性药物监测对于器官移植患者以及患有AIDS的患者尤其重要(参见，例如：Drug.Ther.Perspect.17(22)(2001)8-12)。大多数进行实体器官移植的患者需要终身免疫抑制治疗以防止同种异体移植排斥。但是，因为许多免疫抑制剂具有很窄的治疗范围并且与各种毒性和潜在药物相互作用相关，因此治疗性药物监测(TDM)和患者临床评估的联合使用将是尤其重要的。

他克莫司是首先于1994年获得美国食品和药物管理局(US Food andDrug Administration(FDA))批准的用于防止肝同种异体移植排斥的大环内酯类抗生素。于体外其效力比环孢霉素高多至100倍，并且临床上，其与组织排斥发生率的更显著降低有关。已证实他克莫司作为经受了各种移植过程的患者中的首要免疫抑制疗法，以及作为在进行肝或肾移植后出现高排急性同种异体移植排斥(refractory acute allograftrejection)的患者中的抢救疗法的疗效。治疗谷浓度(therapeutictrough concentration)为5-20μg/L。

由于存在于循环中的至少部分他克莫司被隔离在红细胞中，因此在该药物的临床常规测量中使用全血样品。例如可以通过高效液相色谱(HPLC)、与质谱(MS)联用的HPLC、放射受体分析(RRA)或者通过免疫分析(IA)等检测他克莫司。后两种方法并不能利用相同的灵敏度检测他克莫司及其某些代谢物。这将导致在所采用的方法中出现干扰(Murthy，J.N.等人，Clin.Biochem.31(1998)613-617)。至少在他克莫司的各种代谢物的检测中，HPLC-MS-法可被作为黄金标准。然而，以上提到的所有方法均要求从全血中萃取他克莫司。通常，在临床常规中使用乙腈从全血中萃取他克莫司，并且似乎不存在方法能够进行全血样品中他克莫司的在线测量。

与他克莫司相似，西罗莫司也是大环内酯抗生素。其首先于1999年获得US FDA的批准用于防止肾移植后的同种异体移植排斥，并且实际上，在与环孢霉素和皮质类固醇联合急性使用时也显示出在该方面的令人鼓舞的结果。于体外，西罗莫司的功效比环孢霉素强多至100倍，并且临床上，其表现出与环孢霉素的协同作用，也许能减少环孢霉素的剂量。治疗谷浓度为5-15μg/L。