[发明专利]具有改变的木质素组分的转基因甜高粱及其制备方法

说明书

背景技术

甜高粱(Sweet sorghum)，甜高粱种(Sorghum bicolor(L.)Moench)，是提供可用于制造酒精、糖、糖浆、燃料等的穗粒和茎秆的唯一的农作物。这种植物的主要问题是细胞壁中存在木质素，其不利地影响了有益物质的提取工艺。木质素含量的改变有可能改善植物的质量。所有用于栽培具有减少的木质素含量的变种所采取的传统育种方法，成功率有限。因此，通过基因工程开发具有改变的木质素含量的栽培变种的可能性被认为是完全可能的。

木质素被认为是由对-香豆醇(p-coumaryl alcohol)、松柏醇(coniferylalcohol)和芥子醇(sinapyl alcohol)单体脱氢聚合而成的。这些单体通过苯基丙酸类合成路径(phenylpropanoid pathway)合成。这些单体在结构上仅在芳环(aromatic ring)的3C和5C位置的甲氧基不同。改变单体的比例决定着木质素的类型。木质素分子的变化/异质性取决于特定组分的总量：当对-香豆醇的总量高于其它组分时，其被称为羟苯基木质素(hydroxyphenyl(H)lignin，H木质素)；当松柏醇的总量高于其它组分时，其被称为愈创木基木质素(guaiacyl lignin(G)，G木质素)。类似地，如果芥子醇的含量超过其它组分时，则被称为紫丁香基木质素(syringyllignin(S)，S木质素)。在酶降解过程中，G木质素比S木质素具有更高的抗性。因为在G木质素中存在更多数量的分子间连接而使其更加致密，从而呈现更高的抗性。据观察，木质素的水平随着饲料作物，包括如紫花苜蓿(alfalfa(Jung et al.，1997))的豆类植物和高羊茅(fescue(Buxton andRedfearn，1997)的草本植物的茎干的渐进成熟而增加。另外，木质素组分随着进一步成熟，其中的S/G比渐进地升高(Buxton and Russell，1988)。

已采取多种方法降低木质素的含量和提高S/G比。但是，结果发现是矛盾的，这可能由于缺少对木质素生物合成途径的了解，及由于采用不合适的用于木质素生物合成酶活性的下调方法，这包括转基因、应用的启动子、反义盒的构建的选择，最重要的是转化子的筛选。调控如苯丙氨酸解氨酶(phenylalanine ammonia lyase)、肉桂酸-4-羟化酶(cinnamate4-hydroxylase)、4-香豆酸辅酶A连接酶(4-hydroxycinnamate CoA ligase)的酶的初始反应步骤减少了木质素的含量。但是，这会导致多效性的效果，其包括改变的叶子形状，局部的荧光病变、植株矮小、降低的授粉活性、改变的花的形态和色素沉着，降低了水平的可溶苯丙氨酸，降低了的S/G比等。由其它工作者进行的改变或改良的S/G比而得到的相似效果是导致表型缺陷植物。结果表明，咖啡酸O-甲基转移酶(caffeic acidO-methyltransferase)的活性下调会导致紫丁香基木质素生物合成的剧烈下降，而对愈创木基木质素的影响不大，这个结果是不理想的，因为后者对化学降解具有更高的抗性。在这样的背景下，本发明应用一种不同的方法构建反义基因盒从而提供了一种新的在细胞壁中具有改良的木质素含量的转基因甜高粱植物。

附图说明

图1：用于植物转化的CCoAOMT基因的反义盒的限制性分析

H：Hind III，S：SacI，B：BamHI，E：EcoRI，M：用HindIII/EcoRI消化的Lambda DNA；

图2：用于植物转化的COMT基因的反义盒的限制性分析

H：Hind III，S：SacI，B：BamHI，E：EcoRI，M：用HindIII/EcoRI消化的Lambda DNA；

图3：转基因植物的照片；

图4：通过PCR从基因组中扩增的反义-COMT。泳道1-7表示假定的转化子；-ve表示对照植物；+ve表示细菌中的反义构建体，M表示标准(marker)；

图5：通过PCR从基因组中扩增的反义-CCoAOMT。泳道1-7表示假定的转化子；-ve表示对照植物；+ve表示细菌中的反义构建体，M表示标准(marker)；

图6：双链介导的反义-COMT构建体；

图7：双链介导的反义-CCoAOMT构建体；

图8：双链介导的反义-COMT和反义-CCoAOMT构建体。

发明详述

通过大量的试验，申请人发现木质素组分受CCoAOMT特别影响，受COMT一般影响，当调控时，CCoAOMT对甜高粱植物中的木质素组分具有直接的影响。