[发明专利]用于制备甲基丙二酰辅酶A或乙基丙二酰辅酶A的酶及其用途

说明书

本发明涉及分离的DNA，载体，所述载体用于转化细胞的用途，经转化的细胞，多肽，相对于其野生型而言经基因工程改造的细胞，用于制备经基因工程改造的细胞的方法，通过所述方法获得的经基因工程改造的细胞，所述细胞的用途，以及用于制备有机C₃-和/或C₄-化合物的方法。

有机C₃-和C₄-化合物，例如3-羟基丙酸或3-羟基异丁酸(3-HIB)，是重要的化学前体，并且例如用于制备药用活性物质或在制备生物可降解的聚合物中用作组分。因此，3-羟基异丁酸例如适合于作为用于合成表卡托普利(Epicaptopril)(一种血管紧张肽转变酶(ACE)的抑制剂，其尤其用于治疗高血压)的前体。3-羟基异丁酸也可以通过脱水而转化为甲基丙烯酸。例如，使用3-羟基异丁酸通过脱水来制备丙烯酸，通过氧化来制备丙二酸，或者通过还原来制备1，3-丙二醇。

现有技术中已知用于制备3-羟基异丁酸或3-羟基丙酸的发酵方法。如此，US 4,618,583描述了一种用于制备3-羟基异丁酸的方法，其中用铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)或白黄精朊杆菌(Protaminobacter alboflavus)这些种类的微生物将选自异丁酸、甲基丙烯酸、异丁酰氯、异丁酰氯的甲基酯、甲基丙烯酸的甲基酯、甲基丙烯酸的乙基酯、异丁醇、异丁醇的酯、异丁胺、异丁醛、异丁酰胺或其混合物的底物转化为3-羟基异丁酸。WO-A-03/62173、WO-A-02/42418和WO-A-01/16346描述了借助于重组细胞从碳水化合物或甘油来制备3-羟基丙酸的方法，其中利用了不同的代谢途径。

上面所描述的用于制备3-羟基异丁酸或3-羟基丙酸的发酵方法的缺点尤其在于，在发酵溶液中所形成的目标产物的量太少了，以致不能将该发酵溶液用作用于大规模制备基于3-羟基异丁酸或3-羟基丙酸的第二产物(Folgeprodukt)的起始材料。

此外，在现有技术中已知的用于制备3-羟基丙酸或3-羟基异丁酸的方法中，总是使用C₆-化合物例如葡萄糖或者C₃-化合物例如丙酮酸、磷酸烯醇丙酮酸或甘油，从而这些方法基本上限于使用碳水化合物或甘油作为碳源。然而，对于下列方面存在着日益增长的兴趣：也从C₁-或C₂-碳源例如二氧化碳、甲烷、甲醇或乙醇来制备有机C₃-或C₄-化合物。然而，借助于现有技术中已知的方法，不可能以经济上合理的方式如此地从C₁-或C₂-碳源来合成C₃-或C₄-化合物。

本发明基于这样的任务，即克服产生自现有技术的缺点。

特别地，本发明基于这样的任务，即提供核酸序列，所述核酸序列编码酶，所述酶当在合适的细胞中过表达时，使得这些细胞能够从合适的碳源，特别是从C₁-或C₂-碳源，以尽可能大的量产生有机C₃-和/或C₄-化合物，特别是3-羟基异丁酸或其衍生物。

本发明还基于这样的任务，即提供酶，所述酶与现有技术中已知的酶相比较，在细胞中过表达该酶的情况下，决定性地改善细胞形成3-羟基异丁酸或其衍生物的能力。

此外，本发明还基于这样的任务，即提供细胞，所述细胞能够比现有技术中所描述的细胞更好地，特别是更有效地从合适的碳源，特别是也从C₁-或C₂-碳源，制备在用于制备3-羟基异丁酸或其衍生物的方法中作为可能的中间产物的甲基丙二酰辅酶A或乙基丙二酰辅酶A，或者直接制备3-羟基异丁酸或其衍生物。

分离的DNA为解决开头所述的任务作出了贡献，所述分离的DNA选自下列序列：

a)根据SEQ ID NO：01的序列，

b)无内含子的序列，其衍生自根据a)的序列并且与根据SEQ IDNO：01的序列编码相同的蛋白质或肽，

c)编码包含根据SEQ ID NO：02的氨基酸序列的蛋白质或肽的序列，

d)与根据组a)至c)之一，特别优选地根据组a)的序列至少80％，特别优选地至少90％，更优选地至少95％和最优选地至少99％同一的序列，其中所述序列优选地编码能够将巴豆酰辅酶A转化为乙基丙二酰辅酶A，和任选地也能够将丙烯酰辅酶A转化为甲基丙二酰辅酶A的蛋白质或肽，