[发明专利]在种和/或亚种水平鉴定从临床样品分离的菌株的方法

说明书

本发明涉及鉴定从临床样品分离的菌株的方法。更具体而言，涉 及通过使用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)， 在种和/或亚种水平精确并快速鉴定临床分离物的方法。其还涉及用于 该鉴定的数据库。

MALDI-TOF-MS是用于检查直接从完整细菌细胞表面检测到的蛋 白质的特征谱的技术。

这是一种基于相对分子质量的软电离方法，允许从整个的不同培 养微生物中解吸附(desorption)肽和蛋白质。根据其分子质量和电 荷来分离并检测离子。通过其质量：电荷比率(m/z)来鉴定种。该方 法在数分钟内获得可重复的谱图(spectrum)，其由500-20000m/z 的一系列峰组成。每个峰对应于在激光解吸附期间从细胞表面释放的 分子片段。

MALDI-TOF-MS已经被用于表征细菌。然而，在谱图中鉴定的多种 组分中，只有一些出现在一大群的给定基因种的病菌(germ)中，其 他则是分离特异性的或根据生长条件(温育的培养基、温度...)变化 并且不能用于鉴定细菌以及更通常为病菌的种或亚种。

缺乏鉴定能够区分不同基因种的那些峰的谱图的全局性策略，阻 碍了MALDI-TOF-MS在常规临床微生物实验室中用于诊断基因种的应 用。实际上，这些峰必须对应于在给定基因种的分离物的大部分中出 现的组分，以及大量存在于细胞壁中组分。考虑到基因种中可能的易 变性，似乎是基因种的特征不依赖于单个峰的出现而是依赖于一组峰 的出现，这组峰或多或少地在基因种间是保守的。

本发明人已经发现可以通过如下方法克服这些问题：(i)通过 在MALDI-TOF-MS分析前对待鉴定病菌进行表型分析，和(ii)通过在 特定条件下，特别是涉及基质溶液和参照数据库的选择，进行 MALDI-TOF-MS分析。

从而本发明的一个目的是提供基于MALDI-TOF-MS分析的新方法， 用于在种和/或亚种水平鉴定从临床样品分离的菌株。

本发明的另一个目的是提供由针对于给定病菌的一组菌株而建 立的数据库。

因此本发明涉及使用MALDI-TOF-MS分析，在种和/或亚种水平鉴 定从临床样品分离的菌株的方法，其包括在进行MALDI-TOF-MS分析前 将所述菌株分类的步骤，其中所述分析包括在测试菌株的谱图中保留 如下峰的步骤，与具有最高强度并任意设置为1的峰相比，所述峰的 相对强度大于0.02，特别地大于0.05，更特别地大于0.1。

本发明特别涉及如下方法，其中所述MALDI-TOF-MS分析包括将 待鉴定菌株的谱图特征谱与称为参照数据库相比较，所述参照数据库 包含待鉴定菌株所属病菌组的基因种的代表性菌株的特征性 MALDI-TOF-MS谱图的，所述数据库对于每个代表性菌株包含这样的 峰，与具有最高强度并任意设置为1的峰相比，所述峰的相对强度大 于0.02，特别地大于0.05，更特别地大于0.1，直至其出现在至少2 种亚培养物，优选5种或甚至10种或更多种亚培养物中。

根据本发明进行的峰的选择使得能够准确鉴定在临床样品中存 在的病菌。

分类步骤基于生长条件，和/或菌落的特征，和/或通过显微镜检 查的细菌形态，和/或革兰氏染色，和/或简单的表型测试。

在全部完整细胞上或者在裂解后得到的或对应于细胞组分(细胞 壁、细胞质等)的级分的蛋白质提取物上进行MALDI-TOF-MS技术。该 技术在待测菌株的分离的菌落上可以理想地进行，所述菌株得自在合 适的生长培养基上培养并在合适的温度下孵育的临床样品。

在进行MALDI-TOF-MS技术前，将基质培养基添加到分离菌落中。

例如，合适的基质培养基包括苯甲酸衍生物，例如羟基苯甲酸， 特别是2，5-二羟基苯甲酸(DHB)。

每个谱图是来自含有待分析菌株的孔的不同区域的至少400个， 优选地大于1000个，甚至大于2000个激光发射的总和，在m/z 500-50000，更优选地500-2000，更优选地2000-20000的范围内分析 所述谱图。