[发明专利]用于体细胞核移植的犬科出生率的提高方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种通过体细胞核移植(SCNT)来增加在生产属于犬类 (犬科)的动物中的后代的生产率的方法，更具体涉及通过SCNT来增 加在克隆的犬类中的生产率的方法。该方法包括犬类卵母细胞的去除并 将其与核供体细胞融合以形成核移植胚胎，并将该核移植胚胎转移到代 孕母体(surrogate mother)的输卵管中。在特定细胞循环同步诱导物质 诸如在其制备过程中的细胞周期蛋白B激酶抑制剂(roscovitine)的存在 下培养核供体细胞。

背景技术

近年来，随着基因技术或者遗传工程的发展，报道了许多通过将所 需特性结合到有用作物中得到的各种重组有机体的生产的成功例子。并 且近年来，同样报道了克隆动物，诸如绵羊生产的许多成功例子。克隆 动物的生产实际上只有在生物技术领域中高度积累的技术之后才可能变 为事实，因此可以被认为是相关技术水平的晴雨计。

SCNT技术是一种使有生命后代出生的不需要经过减数分裂和通常 在生殖过程中生产的单倍体生殖细胞保持的技术，是通过将成体双倍体 细胞转移到去核卵母细胞中生产胚胎，然后在体内移植胚胎的新个体发 育的方法。

一般说来，在SCNT技术中，与体细胞移植的受体卵母细胞在经过 体外人工培养到减数分裂中期II之后被使用。然后，为了防止由SCNT 导致的染色体异常的出现，在移植体细胞之前将成熟卵母细胞去核。在 将体细胞注射到成熟卵母细胞的卵黄周隙或者细胞质中之后，将去核卵 母细胞和体细胞通过电刺激彼此物理融合。融合的偶联体通过电刺激或 者化学物质活化，然后移植到代孕母体中以生产有生命的后代。

这种SCNT技术可在下述领域中广泛地被使用，例如在高级动物的 繁殖中，在稀有或者几乎灭绝的动物的保护中，在特定营养物的生产中， 在治疗用生物材料的生产中，在用于器官移植的动物生产中，在患有疾 病或生理紊乱的动物的生产中，以及在医疗上适用于作为器官移植的替 代治疗诸如基因治疗的动物生产中。

通过体细胞核移植克隆哺乳动物的技术首先由Roslin Institute， England的Dr.Wilmut完成，其通过从六岁的老绵羊中获取乳腺细胞， 将该细胞移植到去核卵母细胞中制备核移植胚胎，并在体内移植胚胎， 从而生产了克隆动物Dolly。从那以后，使用得自成年动物的体细胞通过 核移植生产了克隆牛、鼠、山羊、猪和兔(WO 99/37143A2，EP 930009A1， WO 99/34669A1，WO 99/01164A1和US 5,945,577)。

同时，不仅工业动物诸如牛和猪的克隆，而且宠物，诸如狗的克隆 吸引了许多人的兴趣。近年来，在宠物中，猫首先被克隆，在研究基金 中也投入了数百万美元对狗的克隆进行了研究。

但是，从没有发情的母狗的卵巢中取出不成熟的卵母细胞并且在体 外培养卵母细胞以生产成熟的卵母细胞是非常困难的。这是为什么与其 他动物相比通过体细胞核移植克隆狗非常困难的原因之一，即由于狗的 独特物种特异性生殖特征。不过，狗具有与人类类似的生理特性，并具 有与人类类似的发病模式，因此人和狗在病理和生理条件方面是类似的。 实际上可在人类疾病研究中使用的遗传疾病的数量在狗中有224种，这 显著大于猪中的65种或者猫中的136种(http://omia.angis.org.au/)。因 此，如果这种遗传特定被用于生产克隆狗以便研究人类疾病模式，克隆 狗将极大地有助于人类疾病研究。出于这种原因，克隆狗的尝试已经进 行了很长时间，但狗克隆的成功率仍然很低，并且狗的克隆被认为难以 成功。因此，需要发展对于提高犬类克隆效率的有效方法。

因此，本发明的发明人已经进行了使用SCNT方法来生产克隆犬类 的改进方法的研究，结果发现克隆犬类可以通过这种方法高效生产，即 在该方法中的核供体细胞制备过程中加入特定物质，诸如细胞周期蛋白 B激酶抑制剂，从而完成了本发明。

本发明的目的在于提供生产犬类核移植胚胎的方法，以及使用 SCNT技术增加克隆有生命的后代的生产率的方法。

本发明的另一目的在于提供通过所述方法生产的犬科核移植胚胎。

本发明的还以目的在于提供增加了生产率的生产克隆犬的方法，所 述方法包括将所述核移植胚胎转移到代孕母体中以生产有生命的后代的 步骤。