[发明专利]敲除酰胺酶基因的产腈水合酶工程菌及其构建方法和应用

权利要求书

1.一种产腈水合酶工程菌，其特征在于所述的工程菌是红色红球菌 (Rhodococcus ruber)TH3(amdA-)；所述的红色红球菌TH3(amdA-)保藏于 中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏登记号为CGMCC No.2381。

2.权利要求1所述的产腈水合酶工程菌的构建方法，按照如下步骤进行：

(1)以P1和P2为引物，以携带有酰胺酶基因的原始菌的基因组DNA为 模板进行PCR扩增，并回收扩增片段；所述的引物为：

上游引物P1：5′-TCAGAATTCGCGGTGGTCAACTACAAGA-3′

下游引物P2：5′-GATGGATCCAACAGGTGATTCTGGGACTG-3′；所述 的原始菌为红色红球菌TH(Rhodococcus rubber TH)，该菌株于2008年2月 27日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏登记号 为CGMCC No.2380；

(2)将步骤(1)所得扩增片段与质粒载体分别用EcoRI酶和BamHI酶在 36～38℃下进行双酶切反应4～6h；然后将酶切产物纯化，再用T4 DNA连接 酶在3～5℃进行连接反应14～16h，得连接反应物；

(3)将连接反应物转化E.coli JM109感受态细胞，涂布LB固体培养基上， 挑选阳性克隆，并进行培养，然后提取小量质粒进行酶切验证，得带有酰胺酶 基因片段的重组自杀质粒；

(4)将重组自杀质粒以电穿孔转化法转入原始菌；

(5)将步骤(4)所得转化后的菌液涂布在抗生素抗性LB固体培养基上， 筛选阳性菌落，即获得了阻断酰胺酶基因表达的产腈水合酶工程菌。

3.按照权利要求2所述的构建方法，其特征在于其步骤(2)中所述的质 粒载体是pPHU281、大肠杆菌pUC系列或pET系列。

4.按照权利要求3所述的构建方法，其特征在于其步骤(3)中所述的酰 胺酶基因片段是指含有SEQ ID NO：3所示的DNA序列、SEQ ID NO：3所 示DNA序列的延伸片段、SEQ ID NO：3所示DNA序列的部分片段、或与 SEQ ID NO：3具有70％以上同源性的DNA序列或其片段。

5.按照权利要求4所述的构建方法，其特征在于其步骤(5)中所述的筛 选的标记基因是四环素抗性基因、卡那霉素抗性、红霉素抗性基因、氯霉素抗 性基因。

6.权利要求1所述的产腈水合酶工程菌在生产丙烯酰胺中的应用。