[发明专利]敲除酰胺酶基因的产腈水合酶工程菌及其构建方法和应用

说明书

技术领域

本发明属于工业微生物领域，具体地说涉及一种敲除了酰胺酶基因的产腈 水合酶工程菌及其构建方法和这种腈水合酶工程菌在生产丙烯酰胺上的应用。

背景技术

聚丙烯酰胺(PAM)被称为“百业助剂”，在三次采油、水处理、造纸、采矿、 冶金、洗煤和制造高吸水性树脂等工业生产领域具有非常广泛的应用。聚丙烯 酰胺的单体——丙烯酰胺(Acrylamide，分子式为C₃H₅NO，结构式为 H₂C＝CHCONH₂)的生产一般是以丙烯腈为原料，进行催化水合而成。丙烯酰胺 的水合方法经历了硫酸水合法、铜催化法、微生物法三个发展阶段。由于微生 物法具有反应在常温常压下进行、能耗低、操作简单、安全、丙烯腈转化率高、 产物浓度和纯度高等优点，目前，已经成为丙烯酰胺生产的主要方法。

利用微生物法生产丙烯酰胺的方法主要从菌株的筛选和驯化以及生产工艺 的建立和改造等两个方面开展工作。

在生产菌株的发现、驯化、诱变和改造方面，日本山田秀明研究组在专利 《生物学生产酰胺的方法》(专利号：ZL88106735))中公开了一种野生玫瑰 色红球菌J-1；日本化学工业株式会社在专利《利用微生物制备酰胺的方法》(专 利号：ZL86100062)公开了一种红球菌S-6、氧化节杆菌和黄色微杆菌；英国 西巴特殊化学水处理有限公司在专利《紫红红球菌菌株NCIMB 41164及其生产 腈水合酶的用途》(申请号：200480035487.1)中公开了一种了紫红红球菌 NCIMB 41164菌株或其突变体；美国亚什兰许可和知识产权有限公司在专利 《腈水合酶生产菌株紫红红球菌M33的培养方法》(申请号：200480043243.8) 中公开了一种紫红红球菌M33；上海市农药所在专利《微生物催化法生产丙烯 酰胺》(申请号：03115536.7)中公开了野生丙酸棒杆菌及其驯化菌株等不同的 微生物进行丙烯酰胺的微生物法生产；清华大学在专利《提高腈水合酶产物耐 受性的定向培育法》(专利号为：ZL03130658)中公开了获得耐受性腈水合酶 的方法。

近年来，在转化丙烯腈生产丙烯酰胺的基因研究及基因工程改造方面，日 本三菱化成株式会社对来自根瘤菌属的腈水合酶基因和蛋白申请了专利《具有 腈水合酶活性的新型蛋白和编码该蛋白的基因》(申请号：93106122.9)；三井 化学株式会社对来自嗜热假诺卡氏菌JCM3095的腈水合酶的蛋白以及编码它 的基因申请了专利《参与活化腈水合酶的蛋白以及编码它的基因》(专利号： ZL99106291.4)，《新型腈水合酶》(专利号：02156180.X)，并研究了该基因在 重组大肠杆菌中的表达；德国底古萨股份公司申请了《红球菌属的腈水合酶》 (申请号：200580008206.8)；日本三菱丽阳株式会社公开了《改良型腈水合 酶》(申请号：200580016665.0)，提供了对腈水合酶基因进行定点突变来提高 耐热性的方法；清华大学从诺卡氏菌中克隆获得了腈水合酶基因并申请了专利 《一种腈水合酶及其编码基因与应用》(专利号：ZL 200410042576.0)，进一 步对该基因在重组大肠杆菌中的突变和高表达进行了研究。

在利用腈水合酶生产丙烯酰胺的菌株中，除腈水合酶外，还都存在酰胺酶 (amidase)，酰胺酶可以将腈水合酶催化产生的丙烯酰胺进一步转化生成副产物 丙烯酸，从而严重影响丙烯酰胺的质量和产量，同时增加分离纯化的难度和生 产成本。腈水合酶基因与酰胺酶基因通常以一个大基因簇的形式(如： Pseudomonas Chlororaphis B23、Rhodococcus sp.N771、Rhodococcus rhodochrous J1、Rho dococcus sp.RHA1及Bac illus sp.BR449等)或者独立基 因簇的形式(如：Nocardia farcinica IFM 10152和Rhodococcus rhodochrous sp. M8等)存在于菌株的染色体基因组中(Brandao等.Applied and Environmental Microbiology，2003，69(10)：5754-5766；Ryabchenko等.Genetika，2006， 42(8)：1075-82.)。如果能抑制或敲除酰胺酶基因，可以避免在丙烯酰胺生产过 程中大量生成副产物丙烯酸，从而减轻精制工段的分离纯化压力，显著降低生 产成本。