[发明专利]蛋白质分析

说明书

发明领域

描述了用于在存在纤维蛋白原的情况下测量凝血酶活性的方法或在存在凝血酶的情况下测量纤维蛋白原功能的方法。 

发明背景： 

纤维蛋白原和凝血酶是参与血管损伤后止血的关键蛋白，并且对于血凝块的形成非常重要。纤维蛋白原和凝血酶可以以粉末形式或以非水性悬浮液混合，而不会引起典型的凝块反应，从而阻止纤维蛋白凝块的形成，直到蛋白在水性介质或其它在其中蛋白是可溶的液体环境中形成水化合物。这些呈粉末形式的蛋白的混合物具有各种潜在的生物医学应用，包括局部止血、组织修复、药物递送等。此外，可以将这些蛋白的混合物以粉末形式装载至载体或基质或其它医学装置中，以形成可以例如用作止血装置的产品。 

凝血酶的凝块活性通常通过将溶液中的凝血酶与溶液中已知的纤维蛋白原量混合来测量。在合适的条件下，在两种蛋白混合后凝块形成的速率取决于凝血酶的活性。将具有未知量凝血酶的样本的凝块形成的速率与凝血酶参照或凝血酶标准品的凝块形成的速率相比较以确定样本的活性。 

凝血酶的活性是任何凝血酶/纤维蛋白原产品的重要属性，并且将决定其官能度。尽管游离凝血酶的测量是简单的，但当凝血酶和纤维蛋白原在未反应的混合物中时测量凝血酶的活性是具有挑战性的，因为其测量一般需要将蛋白质混合物进行水合及溶解，而溶解的凝血酶和纤维蛋白原之间的纤维蛋白凝块形成在水合后即马上开始。此外，由于已知凝血酶与立即形成的纤维蛋白凝块特异性地结合并相互作用，凝血酶变得结合在纤维蛋白凝块上且不再是游离地可溶解于水合溶液中并且使得无法用于随后的凝血酶测量。因此，通过水合和凝块形成的任何凝血酶/纤维蛋白原产品凝血酶活性的任何结果测量都仅仅是部分的，因此是不精确的。 

此外，当蛋白质在未反应的混合物中被装载至载体、基质或医学装置中时，需要将蛋白质从基质中移出来以精确地测量凝血酶活性，例如，如果载体、基 质或医学装置由于物理化学或光学干扰测量检测系统而对蛋白质活性或功能测量产生不利影响的话。为了克服来自载体、基质或医学装置的干扰，蛋白质的移出或提取需要在不将混合物暴露于水性条件的情况下进行，水性条件会导致妨碍随后测量的凝块的形成。 

纤维蛋白原最常通过最初由Clauss描述的方法测量，其基于凝块形成的速率测量纤维蛋白原的官能度。在典型的Clauss分析中，将未知量的可溶解的纤维蛋白原与过量凝血酶混合。这样的纤维蛋白原和凝血酶比例使得纤维蛋白原成为限制速率的反应物，并且凝块形成速率是纤维蛋白原浓度的函数。快的凝固时间是高纤维蛋白原浓度的指标。反之，更长的凝固时间是低浓度的功能纤维蛋白原的指标。功能纤维蛋白原的量可以通过将样本的凝固时间与用来建立标准曲线的标准品系列的凝固时间相比较而量化。样本中纤维蛋白原的浓度可以基于衍生自标准品凝固时间的方程式以数学方式计算而确定。 

尽管溶液例如人类血浆中的纤维蛋白原的测量可以通过已建立的方法进行，然而当纤维蛋白原与凝血酶一起存在时评估纤维蛋白原的官能度则是一个难题。混合物的水合将导致凝血酶介导的纤维蛋白原至不可溶纤维蛋白凝块的转变。一旦产生纤维蛋白，任何随后的纤维蛋白原的测量不再是可能的，因为导致纤维形成的纤维蛋白肽从纤维蛋白原的释放实质上是不可逆的。 

因此，仍然有这样的需求，即在存在纤维素原的情况下精确测量凝血酶活性以及在存在凝血酶的情况下测量纤维蛋白原的官能度。 

附图详述： 

图1显示了失活溶液中pH对恢复凝血酶活性的影响。 

发明简述： 

本文描述了用于确定第一反应组分和第二反应组分的混合物中第一反应组分或第二反应组分的活性或官能度的方法，其包括步骤：(a)可逆地抑制第一反应组分以产生具有失活的第一反应组分和第二反应组分的混合物；(b)当评估第一反应组分活性时，往混合物中加入过量的第二反应组分，或当评估第二反应组分的活性时，加入过量的第一反应组分；(c)可逆地活化第一反应组分；(d)允许第一反应组分与混合物中的第二反应组分和过量的第二反应组分反应，或允许第一反应组分与混合物中的第二反应组分和过量的第一反应组分反应；以及(e)确定最初存在于干混合物中的第一或第二反应组分的活性或官能度。

发明详述：