[发明专利]人工皮肤黑色素瘤组织的制作方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种人工皮肤黑色素瘤组织制作方法，特别是涉及以人皮肤角质形成细胞、黑色素瘤细胞及基质材料制作皮肤黑色素瘤组织的方法。

背景技术

恶性黑素瘤(malignantmelanoma，MM)是由皮肤和其它器官的黑素细胞系统所发生的一种恶性程度相当高的肿瘤，容易发生转移，一般黑色素瘤患者预后较差，进展期患者平均生存期仅有6～9个月，是一种严重威胁人们健康和生命的疾病。近年来，在全球范围内该病的发病率呈逐年上升趋势，一般认为可能是由于对紫外线暴露增加的原因，也可能是多种因素综合作用导致的结果。目前，人们对恶性黑素瘤的发病原因和机制仍然不甚清楚，从而带来了诊断和治疗的困难。为此，引起了医学领域的高度关注，国内外科学家对其发病机制、诊断、治疗方法的筛选，疗效的验证及肿瘤转移的机制及其防治等诸多黑素瘤所涉及的相关因素进行了大量研究和探索。围绕这些问题的研究和实验以往大多是在动物体内进行的(HabibFA，Lobocki C，Ezhuthachan R，et al.Interferon(alpha)2b inhibits the murinemelanoma cell line Cloudman S91 in vivo but not in vitro：a model for studyingtumor cell-cytokine interactions/discussion.Am Surg 2001；67(3)：257-260；牟霞，陆洪光，等.B16小鼠恶性黑色素瘤模型的建立中华皮肤科杂志2004；37(10)：613)。动物试验会造成大量动物死亡，并且实验费用较高，实验周期较长，消耗较大。近年来随着人们普遍增长的对动物的保护意识，用替代性人工肿瘤组织和器官等生物活组织材料进行黑素瘤的研究成为必然。显然，组织工程肿瘤器官的研究对于最终了解肿瘤的形成机制、肿瘤的侵袭与转移，以及探索抗肿瘤方法或药物都有可预期的广阔前景及潜在的理论和实际应用价值。

最近该领域的相关进展包括MaaserK(MolBiolcell，1999；10：3067—3079)等报道用异种来源的牛皮肤胶原构建三维胶原基质，并在此基础上种植恶性黑色素瘤细胞取得成功。EvesP(BritishJDermatol 2000；140；210-22)等用人的去细胞的真皮组织(de-epidermizedacellularhumandermis，简称DED)作为基质材料，体外培养黑色素瘤组织取得成功。我们用人的去表皮的真皮组织(humande-epidermizedhumandermis，简称HDED)接种MV3黑色素瘤种子细胞体外构建黑色素瘤体外模型取得成功(陆洪光；彭琳琳：一种黑色素瘤体外模型的制作方法，申请号200710201275.1)。以往技术报告和发明在一定程度上提供了体外研究皮肤黑色素瘤的组织器官模型，然而均在不同程度上存在一些不足，尚待进一步改进和完善：

1、Maaser K所构建的黑色素瘤组织选用的基质材料是用异种牛皮提取的胶原，与人体组织存在差异。

2、尽管EvesP用人的去细胞的真皮组织(DED)作为基质材料，然而也有一些技术问题值得商榷，比如(1)DED制作比较复杂，用1mol/L氯化钠处理6～8小时后的真皮表面基底膜成分未有检测说明；(2)黑色素瘤种子细胞专属于Ghanem’s实验室，来源受限；(3)在黑色素瘤种子细胞种植过程中，为防止种子细胞脱离，需用特定金属环固定，给实际操作带来了不便，并且不能确保种子细胞粘付于DED。

3、2007年我们提出的发明申请“一种黑色素瘤体外模型的制作方法”(申请号200710201275.1)，克服了以往技术的不足，制作出一种以人工皮肤为基质材料的恶性黑色素瘤体外模型，并实施用于肿瘤的侵袭性和转移的研究，显示了制作方法简便、易操作、可重复性强、便于观察、干预和调控性强等特点。但该模型存在种子细胞单一(仅有黑色素瘤细胞，缺乏表皮种子细胞)的情况，在凭估黑素瘤与表皮相互作用过程等有关的肿瘤形成机制时，缺乏一定的表皮组织学支撑。

这是因为皮肤由表皮，真皮及皮下组织组成。表皮在皮肤的最外层，主要由角质形成细胞(keratinocyte)及产生的角蛋白构成。角质形成细胞与表皮其它细胞(如黑素细胞，朗格汉斯细胞)形成皮肤天然保护屏障，使人体免受各种有害物入侵，维持人体内环境的稳定等方面起重要作用。而原发性皮肤黑素瘤大多发生于表皮和真皮交界处，一般来说瘤细胞在此处增生，形成微小瘤灶，穿过基底膜侵入真皮。