[发明专利]人工皮肤黑色素瘤组织的制作方法

权利要求书

【权利要求1】一种人工皮肤黑色素瘤组织的制作方法，其特征在于：首先在去表皮真皮组织上接种人皮肤角质形成细胞和黑色素瘤细胞；然后采用液下培养和空气—液面培养相联合的方式，使角质形成细胞及黑色素瘤细胞在HDED生长，构建出含有人皮肤角质形成细胞的皮肤恶性黑色素瘤组织；最后用组织学及免疫组化技术方法观察皮肤恶性黑色素瘤组织生长情况。

【权利要求2】根据权利要求1所述的人工皮肤黑色素瘤组织的制作方法，其特征在于：在去表皮真皮组织上接种人皮肤角质形成细胞与黑色素瘤细胞的比例为3：1。

【权利要求3】根据权利要求1所述的人工皮肤黑色素瘤组织的制作方法，其特征在于：液下培养和空气—液面培养相联合的方式是在5％ CO2、37℃无菌条件下进行的，其操作过程如下：将HDED置于经灭菌处理过的六孔板上，将浓度为2×105/ml角质形成细胞悬液接种于HDED表面，置于37℃、5％ CO2环境中孵育2小时，后加6.7×104/ml黑色素瘤细胞悬液于HDED面，细胞培养箱中静置3小时后，每孔加入5ml的完全培养基进行液下培养，3天后改为气液界面培养，37℃、5％CO2环境中继续培养，每3天换液一次，连续培养12-15天，取出后即进行黑素瘤组织学检查。

【权利要求4】根据权利要求1或2所述的人工皮肤黑色素瘤组织的制作方法，其特征在于：所述的黑色素瘤细胞是MV3黑色素瘤细胞。

【权利要求5】根据权利要求1所述的人工皮肤黑色素瘤组织的制作方法，其特征在于：去表皮真皮组织制备方法如下：取健康成人皮肤标本，用PBS清洗标本表面附着物，常规消毒，去除标本皮下脂肪组织层，制成1×1cm2的皮片，浸于56℃PBS中30分钟，然后去除标本表皮，将去除表皮的标本置于聚乙烯塑料瓶中，将塑料瓶密封后迅速置入液氮中5分钟，取出后室温放置30分钟，依此连续10个循环后，即得HDED基质材料。

【权利要求6】根据权利要求1所述的人工皮肤黑色素瘤组织的制作方法，其特征在于：人皮肤角质形成细胞制备方法如下：首先取健康男性包皮环切术后的包皮，将新鲜标本浸入D-Hanks缓冲液中，4℃保存备用，6小时内使用；其次将包皮在无菌条件下用PBS冲洗5遍，剪除皮下脂肪组织，并剪成约2mm×5mm皮条，浸入0.25％Dispase酶中，4℃共消化16-17个小时，次日取出后PBS冲洗，分离表皮，用0.25％胰蛋白酶-0.01％EDTA室温下消化2～3min，含10％FBS的DMEM-F12(3：1)终止消化；然后进行离心(1000r/min，5min)及弃上清操作，PBS重混悬细胞，再离心、弃上清，使K-SFM混悬，细胞计数板计数，KC细胞密度为(5-6)×105/ml，接种于细胞培养瓶中；置于细胞培养箱中孵育，24小时后首次换液，后2～3天换液一次，培养细胞达到70％-80％融合状态时用0.25％胰蛋白酶-0.01％EDTA消化传代，按(1-2)×105/ml接种。

【权利要求7】根据权利要求1或2所述的人工皮肤黑色素瘤组织的制作方法，其特征在于：所述接种的角质形成细胞浓度为2×105/ml，黑素瘤细胞浓度为6.7×104/ml。

【权利要求8】根据权利要求3所述的人工皮肤黑色素瘤组织的制作方法，其特征在于：所述的完全培养基是DMEM培养基与F12营养液以3：1比例混合，加新鲜10％胎牛血清配制。

【权利要求9】根据权利要求5所述的人工皮肤黑色素瘤组织的制作方法，其特征在于：所述的HDED基质材料制备后放于-70℃冰柜中无菌储藏备用，应用前-70℃，-20℃，-4℃，室温，依次解冻；在接种前浸于完全培养基中，在37℃、5％CO2环境中浸泡24小时。