[发明专利]靶向人FAK和PLK1基因的RNA干扰表达质粒-阳离子脂质体-肝素抗肿瘤复合物

说明书

技术领域

本发明属于肿瘤基因治疗领域，具体涉及靶向人FAK和PLK1基因的RNA干扰表达质粒-脂 质体-肝素抗肿瘤复合物。

背景技术

目前肿瘤的基因治疗获得了蓬勃快速的发展，但是至今为止，仍然存在许多需要解决的 问题。而其中急需解决的问题是：目前用于肿瘤基因治疗的基因太少，能抑制肿瘤生长的基 因为数不多，急需提供更多可供利用的基因；另外，由于肿瘤的发生、发展、转移等过程是 一个多基因参与、涉及多条信号通路的复杂网络系统，因此单个基因治疗或单一治疗方法往 往疗效有限。因此，未来基因治疗发展的重点将在于挖掘并鉴定在临床上有治疗价值的基因 ，探索多个具有不同抗肿瘤作用机理的基因联合治疗以及将肿瘤基因治疗与化疗、放疗合用 。

Focal-adhesion kinase(FAK)基因是一个整合素家族成员基因，是一种定位于黏着斑 的非受体型酪氨酸激酶，参与调控细胞的运动与增殖等，它可促进细胞向细胞外基质附着， 在肿瘤发生、发展、转移、预后过程中扮演重要功能。FAK基因可以促进肿瘤细胞迁移，从 而导致肿瘤扩散、转移，同时也影响肿瘤治疗的预后效果。大量研究发现FAK基因在多种肿 瘤组织中较正常组织表达明显增高，在发生肿瘤转移和预后差的病人组织中检测到FAK基因 表达水平显著上调，如结肠癌、乳腺癌、肺癌、肝癌、胰腺癌、前列腺癌、卵巢癌、宫颈癌 、口腔上皮癌、头颈部鳞状上皮癌、黑色素瘤、急性髓细胞样白血病、甲状腺癌等恶性肿瘤 中表达增加，而且FAK基因表达水平上调直接与肿瘤的发生、发展、转移、预后相关，因此 ，FAK基因是肿瘤治疗潜在的理想靶标。

PLK1(polo like kinase 1)激酶属于高度保守的丝氨酸/苏氨酸激酶家族成员，对于细 胞周期调控具有重要作用，包括PLK1、PLK2、PLK3、PLK4共四个成员，而研究最为深入、最 有治疗前景的靶标的是PLK1。PLK1在多种恶性肿瘤中过表达，是多种肿瘤诊断的潜在靶标， 大量研究发现PLK1在肺癌、肝癌、结肠癌、卵巢癌、乳腺癌、胰腺癌、前列腺癌、胃癌、黑 色素瘤、胶质瘤、淋巴瘤等恶性肿瘤中异常高表达，并可以引起染色体分裂异常活跃，诱发 正常细胞癌变，已被确认与许多肿瘤的发生、发展有关，同时也与肿瘤患者预后差正相关， 是多种肿瘤治疗的理想靶标。

目前，RNA干扰已经广泛用于肿瘤治疗研究，但大多数是利用化学合成的siRNA对肿瘤进 行治疗，而化学合成的siRNA治疗存在以下缺点：化学合成的siRNA用量大，使用成本高，产 业化难度大；化学合成的siRNA在体内作用的稳定性差，时间短，每次使用时对操作人员的 技术要求较高；多次输注对患者的生活质量也有不好的影响。同时从文献报导来看，单个基 因的RNA干扰效果往往不是十分理想，因为肿瘤的发生、发展、转移、侵袭等是一个涉及多 基因、多步骤复杂的过程，可能涉及的是多个基因、多条信号通路，所以针对多个靶点基因 进行RNA干扰治疗可能是一个更好的选择，效果也有可能更好，同时将双基因甚至多基因的 RNA干扰治疗与化疗、放疗合用在临床肿瘤治疗方面可能更有前景，但目前未见相关报道。 另外，治疗基因的有效导入也一直是影响基因治疗效果的重要因素，在提高治疗基因的转入 效率和增强靶向性等方面，目前虽然有众多研究，但是离找到能广泛普遍适用的方案还有极 大的距离。仍然要根据不同的基因治疗方案进行不同的开发。

发明内容

本发明所要解决的第一个技术问题是提供一种能靶向FAK和PLK1双基因的RNA干扰表达载 体。该RNA干扰表达载体能在体内表达针对FAK基因上由SEQ ID NO.1所示靶点的RNA干扰序列 和针对PLK1基因上由SEQ ID NO.2所示靶点的RNA干扰序列。

其中，表达针对FAK基因上由SEQ ID NO.1所示靶点的RNA干扰序列的表达框架的正义链 序列为SEQ ID NO.3所示，表达框架反义链序列为SEQ ID NO.4所示。

其中，表达针对PLK1基因上由SEQ ID NO.2所示靶点的RNA干扰序列的表达框架正义链序 列为SEQ ID NO.5所示，表达框架反义链序列为SEQ ID NO.6所示。

其中，上述的表达载体为质粒。

其中，上述质粒的骨架为pGensil-2，多克隆位点部分有所区别，含有人的U6和H1启动 子，分别用于启动FAK基因RNA干扰表达框架和PLK1基因RNA干扰表达框架。