[发明专利]环介导等温扩增检测人前列腺癌特异基因DD3PCA3试剂盒

权利要求书

1.一种环介导等温扩增检测人前列腺癌特异基因DD3^PCA3的引物，其特征在于：由一对外引物和一对内引物组成，其序列分别如下所示：

外引物1具有序列表中SEQ ID NO.2所述的碱基序列，具体序列如下所示：AGTGACATGTTTTTGCACATT；

外引物2具有序列表中SEQ ID NO.3所述的碱基序列，具体序列如下所示：CATCCTTTAAGGAACACATCAA；

内引物1具有序列表中SEQ ID NO.4所述的碱基序列，具体序列如下所示：TCCCAGGGATCTCTGTGCTTCAGCCCCTTTAAATATCCAC；

内引物2具有序列表中SEQ ID NO.5所述的碱基序列，具体序列如下所示：CGCCATCTTGGGTCATCGATATGTCCTTCCCTCACAAG；

其中，所述的一对外引物与一对内引物的摩尔数之比为1：6～8。

2.一种人前列腺癌特异基因DD3^PCA3定性检测试剂盒，其特征在于：由一套引物、10倍环介导等温扩增反应缓冲液、DNA聚合酶、阳性对照、阴性对照、逆转录酶和显色剂组成；所述的一套引物是由一对外引物和一对内引物组成，其序列分别如下所示：

所述引物包括2条外引物和2条内引物，其序列分别如下：

外引物1具有序列表中SEQ ID NO.2所述的碱基序列，具体序列如下所示：AGTGACATGTTTTTGCACATT；

外引物2具有序列表中SEQ ID NO.3所述的碱基序列，具体序列如下所示：CATCCTTTAAGGAACACATCAA；

内引物1具有序列表中SEQ ID NO.4所述的碱基序列，具体序列如下所示：TCCCAGGGATCTCTGTGCTTCAGCCCCTTTAAATATCCAC；

内引物2具有序列表中SEQ ID NO.5所述的碱基序列，具体序列如下所示：CGCCATCTTGGGTCATCGATATGTCCTTCCCTCACAAG；

其中，所述的一对外引物与一对内引物的摩尔数之比为1：6～8；所述DNA聚合酶为具有链置换作用的Bst DNA聚合酶，活力为8个活性单位/微升；所述阳性对照为含人前列腺癌特异基因DD3^PCA3cDNA的样品；阴性对照为双蒸水；所述逆转录酶采用鸟类成髓细胞白血病病毒逆转录酶，活力为10个活性单位/微升；所述显色剂为20×SYBR Green I。

3.根据权利要求2所述的人前列腺癌特异基因DD3^PCA3定性检测试剂盒，其特征在于：所述10倍环介导等温扩增反应缓冲液由200mM三羟甲基氨基甲烷盐酸盐、100mM氯化钾、100mM硫酸铵、40～100mM硫酸镁、4～10M甜菜碱、5～10mM的dNTPs和1％的质量百分浓度的曲拉通X-100组成。

4.权利要求2所述试剂盒定性检测人前列腺癌特异基因DD3^PCA3的检测方法，具体包括以下步骤：

(1)常规方法提取组织、血液或尿液中的RNA；

(2)配置扩增体系，在每25μl扩增体系中，含外引物5pmol，内引物30～40pmol，10倍环介导等温扩增反应缓冲液2.5μl，步骤(1)中RNA提取液2～5μl，1μl的Bst酶，0.1μl鸟类成髓细胞白血病病毒逆转录酶，其余为水；60～65℃恒温反应1小时；反应结束后加1μl显色剂，于紫外灯下观察，颜色变为绿色说明检测结果阳性。