[发明专利]人ARMET蛋白单克隆抗体制备方法及检测试剂盒

说明书

技术领域：

本发明涉及的是一种人体蛋白质ARMET(Arginine rich，mutated in early stageof tumors，亦称ARP、MANF)的表达纯化、单克隆抗体制备及其检测的方法。

背景技术：

ARMET(Arginine rich，mutated in early stage of tumors)在公共数据库中也被称为ARP(arginine-rich protein)或MANF(mesencephalic astrocyte-derivedneurotrophic factor)，其氨基酸序列见图1。最初的研究发现，该基因在早期肿瘤中有单个核苷酸突变(Shridhar et al，1996a and 1996 b)，而随后的研究却发现，ARMET基因中出现的这种突变属于正常基因的多态性，而非肿瘤所特有(Evronet al.，1997；Tanaka et al.，2000)。这一研究结果使人们一度失去了对ARMET的研究兴趣。但Petrova及同事在体外传代的大鼠中脑星形胶质细胞的培养液中分离得到的神经营养因子MANF，其人类的同类物就是ARMET(Petrova et al.，2003)，分子量在20kD左右。他们的研究并发现，重组的人ARMET可选择性地作用于体外培养的多巴胺能神经元，促进其存活，在低剂量时作用优于神经营养因子GDNF和BDNF(Petrova et al，J Mol Neurosci 2003)。2007年《Nature》上的一篇报道格外引人注意，该研究发现，含保守序列的多巴胺能神经元营养因子(Conserved Dopamine Neurotrophic Factor，CDNF)对多巴胺能神经元有保护作用(Paivi Lindholm et al，Nature 2007)。而CDNF是ARMET(MANF)的同类物，都属于含8个半胱氨酸保守序列的蛋白家属，且ARMET与CDNF的氨基酸同源性为59％。

到目前为止，与ARMET相关的报道不超过10篇，其中早期的(90年代中期)4篇是关于它在早期肿瘤中的单基因突变；2篇有关于它与内质网应激的关系；2篇有关对多巴胺能神经元影响的报道(J Mol Neurosci 2003；Neuroreport2006)；还有1篇报道是关于它的类似物CDNF对中脑多巴胺能神经元的保护作用(Nature 2007)。对ARMET的研究目前世界范围内仅限于几个实验室，其功能目前还不清楚。对它的研究目前没有广泛开展的原因与缺乏检测它的方法有关，因为到目前为止还没有市售的商品化的ARMET蛋白及相关抗体。

发明内容：

本发明的目的是提供一种人ARMET蛋白抗体制备方法及检测试剂盒，用于ARMET蛋白的检测。

本发明的的技术方案如下：

人ARMET蛋白抗体制备方法，包括以下步骤：

(1)、ARMET基因克隆、蛋白的诱导表达与纯化

用限制性内切酶(NcoI/XhoI)将人ARMET蛋白的cDNA编码序列克隆到pET28a(+)载体上，表达C端融合6个组氨酸的重组ARMET蛋白；将pET28a(+)-ARMET质粒转化感受态细胞BL21，诱导表达ARMET蛋白，收集菌体，纯化人ARMET蛋白；

(2)、Anti-ARMET单克隆抗体的制备

用纯化的人ARMET蛋白作为抗原免疫BALB/c小鼠，通过杂交瘤细胞融合方法制备Anti-ARMET单克隆抗体，选择滴度高的杂交瘤细胞进行扩增、冻存，并注入BALB/c小鼠腹腔生产腹水型抗体；

(3)、抗体的纯化

采用辛酸-硫酸铵沉淀法及亲和层析法纯化单克隆抗体。

所述的人ARMET蛋白抗体制备方法，包括以下步骤：其特征在于：

(1)、所述的ARMET基因克隆、蛋白的诱导表达与纯化是指：