[发明专利]人ARMET蛋白单克隆抗体制备方法及检测试剂盒

权利要求书

1、人ARMET蛋白单克隆抗体制备方法，包括以下步骤：

(1)、ARMET基因克隆、蛋白的诱导表达与纯化

用限制性内切酶(NcoI/XhoI)将人ARMET蛋白的cDNA编码序列克隆到pET28a(+)载体上，表达C端融合6个组氨酸的重组ARMET蛋白；将pET28a(+)-ARMET质粒转化感受态细胞BL21，诱导表达ARMET蛋白，收集菌体，纯化人ARMET蛋白；

(2)、Anti-ARMET单克隆抗体的制备

用纯化的人ARMET蛋白作为抗原免疫BALB/c小鼠，通过杂交瘤细胞融合方法制备Anti-ARMET单克隆抗体，选择滴度高的单克隆杂交瘤细胞株进行扩增、冻存，并注入BALB/c小鼠腹腔生产腹水型抗体；

(3)、抗体的纯化

采用辛酸-硫酸铵沉淀法及亲和层析法纯化单克隆抗体。

2、根据权利要求1所述的人ARMET蛋白抗体制备方法，包括以下步骤：其特征在于：

(1)、所述的ARMET基因克隆、蛋白的诱导表达与纯化是指：

用限制性内切酶(NcoI/XhoI)将人ARMET的cDNA编码序列克隆到pET28a(+)载体上，表达C端融合6个组氨酸的重组ARMET蛋白；将pET28a(+)-ARMET质粒转化感受态细胞BL21，置37℃培养箱过夜，以体积比1:100的比例，接种于新鲜的含卡那霉素的LB培养基中扩大培养，37℃振荡培养至菌液A₆₀₀为0.6～0.8，加入IPTG诱导表达2-4小时；收集菌体并裂解，取上清液，加入到已预装好的Ni-beads柱中，用含50mmol/L imidazole的缓冲液洗去非特异结合的蛋白，再用组份为50mmol/L NaH₂PO₄ pH8.0、300mmol/L NaCl、250mmol/L imidazole的洗脱缓冲液洗脱目的蛋白，并将洗脱的蛋白分装保存在-80℃冰箱；

(2)、所述的Anti-ARMET单克隆抗体的制备是指：

①SP2/0细胞的处理：复苏冻存的SP2/0细胞，状态稳定后用8-AG进行筛选，继续培养，待细胞长至将70-80％融合时，收集细胞，用无血清的DMEM悬浮，注射于BALB/c小鼠皮下，待长出实体瘤后，分离培养SP/20细胞，备用；

②免疫方案：将纯化的人ARMET蛋白作为抗原，并与等体积的弗氏完全佐剂充分乳化，制成油包水抗原乳剂；将此乳剂于雌性BALB/c小鼠背部多点皮下注射，200μg/只；10天后再用该抗原加等体积弗氏不完全佐剂腹部多点皮下注射，200μg/只；10天后将纯化的抗原液(200μg)直接注射小鼠腹腔；剪鼠尾取血，用酶联免疫吸附法(ELISA)检测血清抗体效价，滴度较高者备用；在取脾脏前三天尾静脉注射抗原液200μg/只；

③细胞融合：冲击免疫后第3天，无菌取脾制备脾细胞悬液；将Sp2/0骨髓瘤细胞[(1～2)×10⁷个细胞]和免疫的小鼠脾细胞(1×10⁸个细胞)混合，加入0.8mL 50％PEG4000助融；融合2分钟后，缓慢加入不完全培养基，离心，用含20％胎牛血清的HAT培养液重悬，加入饲养细胞，种在96孔板上；37℃ CO₂培养箱中培养。

④克隆转移和检测：融合后每天仔细观察，挑出单克隆，做好标记，待单克隆的孔长至覆盖2/3孔时用ELISA筛选，选取滴度较高的单克隆孔，在显微镜下定位，将单个克隆细胞移入含有HT培养液的24孔中，用移液器吹打分散均匀；

⑤选择抗体滴度高的单克隆抗体进行扩增、冻存或制备腹水型抗体。

3、一种检测人ARMET蛋白的ELISA试剂盒，其特征在于：该试剂盒组成为：

(1)、包被抗体：采用一株杂交瘤细胞产生的抗体；

(2)、固相支持物：采用微孔板，用于包被抗原；

(3)、酶标抗体：用辣根过氧化物酶标记的不同杂交瘤细胞株产生的单克隆抗体(IgG或IgM)；

(4)、阳性对照血清或阴性对照血清；

(5)、酶标抗体稀释液：PBS；

(6)、底物溶液：A液：0.01％TMB，0.01MpH4.5柠檬酸缓冲液；

B液：0.08％过氧化脲，0.1M柠檬酸-0.2M磷酸氢二钠(pH5.0)缓冲液；

(7)、洗涤液：PBS，含0.01％吐温-20；

(8)、终止液：2M硫酸。