[发明专利]一种用于检测猪繁殖与呼吸综合症病毒的试剂盒和检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及用于检测猪繁殖与呼吸综合症病毒的试剂盒和检测 方法，更具体地涉及RT-PCR一步法检测猪繁殖与呼吸综合症病毒的 试剂盒和检测方法。

背景技术

猪繁殖与呼吸综合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS)，亦称蓝耳病，是一种新的有高度传染性的猪病，主 要表现为妊娠母猪早期流产、死胎、木乃伊胎以及产弱仔等繁殖障碍 以及各年龄猪发生呼吸道症状，仔猪死亡率高，感染猪出现免疫抑制 等现象。该病最早于1987年在美国和1990年在欧洲被发现以来，已 传遍世界所有养猪国家，本病隐性感染率高，并呈周期性暴发。据统 计，PRRS每年给美国养猪业造成的直接经济损失为5.6亿美元，而 美国用于该病的防控研究经费高达6亿美元。因此，国内外许多知名 专家和学者将该病称为对养猪业最具危害的两大杀手之一。国际兽疫 局(OIE)将其列为需要通报的B类传染病，我国亦将其列为二类传染 病。值得注意的是，自2006年5月份以来，我国从江西开始发病， 后波及到浙江、江苏、安徽、湖南、山东、河南等许多省市，初步估 算，到2007年初，我国发病地区生猪存栏量已锐减了近三分之一， 造成了极大的经济损失，也给许多生猪养殖场(户)造成了毁灭性地打 击。

国外和国内均已建立了RT-PCR检测方法。国外应用PCR诊断 PRRSV已取得很大进展，许多学者根据PRRSV不同的ORF序列， 设计了不同引物，建立了检测PRRSV核酸的RT-PCR方法。该方法 直接从PAM分离培养物、临床样品(肺泡巨噬细胞、血清和血浆，肺 脏组织以及精液等)中扩增出预期的片断，但该方法仅应用了一对引 物，通过PCR扩增产生一个核苷酸片段。众所周知，RNA病毒具有 高度变异能力，同时PRRSV是一种高度传染性的病毒，因此现有的 检测方法不具有快速，敏感和准确的特点。因此需要研制并开发出快 速，敏感、准确以及价格便宜的PRRSV检测试剂盒和检测方法，以 弥补我国在PRRSV检测上的薄弱环节，同时有利于剔除阴性带毒动 物。

发明内容

本发明要解决的技术问题是快速、敏感、准确以及低成本地检测 猪繁殖与呼吸综合征病毒。

为解决上述问题，本发明提供了一组针对猪繁殖与呼吸综合症病 毒的引物，所述引物包括：

第一对的上游引物，其序列为SEQ ID NO：1；

第一对的下游引物，其序列为SEQ ID NO：2；

第二对的上游引物，其序列为SEQ ID NO：3，

第二对的下游引物，其序列为SEQ ID NO：4；

第三对的上游引物，其序列为SEQ ID NO：5，

第三对的下游引物，其序列为SEQ ID NO：6；

或者上述序列SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：6的向5’端和/或3’端 延长的序列；

或者与上述序列SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：6同源性大于85％ 的序列；

或者与上述序列SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：6碱基互补的序列。

本发明还提供了一种用于猪繁殖与呼吸综合症病毒的检测试剂 盒，所述试剂盒包含RNA酶抑制剂、AMV逆转录酶、Taq酶、无 RNA酶水、One Step RNA PCR混合液、阴性对照以及序列SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：6引物的混合物。

其中所述One Step RNA PCR混合液包含PCR缓冲液、dNTP和 Mg²⁺。

所述阴性对照为无RNA酶水空白对照。

所述阳性对照为为PRRSV HuN4细胞株的RNA，其浓度为0.25 μg/mL。

所述RNA酶抑制剂的浓度为40U/μL，AMV逆转录酶的浓度为 5U/μL，Taq酶的浓度为5U/μL，引物的浓度为50pM/μL，One Step RNA PCR混合液中PCR缓冲液的浓度为10×，dNTP的浓度为10 mM和Mg²⁺的浓度为25mM。

本发明还提供了用所述检测试剂盒检测猪繁殖与呼吸综合症病 毒的方法，所述方法包括以下步骤：

a.提取样品总RNA；