[发明专利]联用磁分离与色谱分析测定混合物中配体亲和力的方法

说明书

发明的技术领域

本发明涉及利用恰当的参考配体与样品混合物制备成测定前样品，在液相启动测定前样 品中各配体竞争结合蛋白上相同活性位点，然后用功能化的磁性纳米材料以磁力回收蛋白-配 体复合物，变性复合物中的蛋白并提取所有结合的配体，用完全相同的色谱条件同步定性鉴 定和定量测定磁分离后提取的混合物中结合配体和测定前样品中各种配体的色谱峰面积或峰 高，在优化条件下利用近似公式推算候选配体相对于参考配体的相对亲和力的方法；此方法 可用于快速鉴定混合物中针对蛋白上特定位点的高亲和力配体，可用于药物筛选、高选择性 探针筛选、抗原表位筛选等生物医药的基础与应用领域。

发明的技术背景

高亲和力且高特异性配体广泛用作临床药物和工具，故测定配体同蛋白的亲和力是生物 医药领域的基本工作之一。目前测定配体与蛋白亲和力最常用方法依赖于候选配体与参考配 体竞争结合，但需分离出结合的参考配体并定量。为了便于定量测定结合的参考配体量，常 用特殊的信号标记参考配体，典型的为放射性同位素标记。显然，同位素标记危害大，操作 不方便。更重要的是，目前常用方法测定配体亲和力都需高纯度候选配体样品和高纯度参考 配体，这无疑增加了发现所需高亲和力配体的成本而效率却极低。另一方面，筛选组合化学 库已成为发现高亲和力配体的关键技术，常规的高通量筛选技术都需要纯样品，这对于应用 组合化学技术是最大成本限制；而从天然产物中制备纯样品不仅成本高而效率低，更容易丢 失高亲和力微量配体。因此，需以混合物为样品且尽可能不用同位素标记的分析技术，从而 快速简便测定混合物中特定配体或多个预期配体的亲和力，降低制备样品的成本且提高样品 制备的效率，使组合化学技术能成为高亲和力配体发现的常规技术。

目前，主要有三类技术可用混合物为样品定量测定其所含配体的亲和力，它们分别是 Schriemer等建立的前线亲和色谱(Angew.Chem.Int.Ed.1998，37，3383-3387)、Von Breeman 等建立的超滤-液相色谱-MS技术(Anal.Chem.2000，72，3853-3859；Mass Spectrom.Rev.2002， 21，76-86.和Anal.Chem.2007，79，9398-402.)、Annis等建立的亲和选择-分子体积排阻-液相 色谱-MS-技术(J.Am.Chem.Soc.2004，126，15495-15503；Anal.Chem.2007，79，4538-4542 和Curr.Opin.Chem.Biol.2007，11，518-526)。但是它们在应用中仍然受到很大限制。前线亲 和色谱技术必需亲和柱，其制备成本高；所用配体混合物中不同配体含量的波动范围有限； 难以可靠鉴定配体的特异性。超滤-液相色谱-MS联用技术的分析效率很低，不适宜于大量样 品快速测定，且定量测定重复性较低。亲和选择-分子体积排阻-液相色谱-MS-技术需特殊装 置连接分子体积排阻系统与LC-MS系统，需用大量的参考配体，分析测定工作量也较大。

另外，von Breeman等还建立了通过将蛋白固定化在磁性纳米材料表面，用于对混合物中 不同配体快速鉴定，但是他们建立的此技术不能定量测定混合物中不同配体的亲和力(Comb. Chem.High Throughput Screen 2008，11，1-6)。

发明内容

本发明以功能化磁性纳米材料回收蛋白-配体复合物为基础，利用非标记参考配体和候选 配体的竞争结合，以及色谱分析定性和定量，从而用近似公式推算候选配体的相对亲和力。

1.本发明的技术方案在实施中涉及如下的特征性步骤(图1)：

(1)以合成的未纯化产物混合物、组合合成产物混合物、天然产物混合物为样品；

(2)选择符合要求的内源配体为参考配体使样品直接为测定前样品，或选择恰当的 外源配体并将其优化量加入样品混合物中得到测定前样品；

(3)选择所需功能化磁性纳米材料；可将蛋白直接或间接固定化在磁性纳米材料表 面以备经磁力回收蛋白与配体复合物，或在竞争结合体系达到平衡后加入以通 过磁力回收蛋白-配体复合物；

(4)在恒温的缓冲体系加入优化量的相应蛋白和适量测定前样品，混匀启动来自测 定前样品中各配体对蛋白上相同活性位点的竞争结合直到平衡；所用蛋白量和 测定前样品量须优化以保障满足定量测定亲和力所要求的条件；