[发明专利]联用磁分离与色谱分析测定混合物中配体亲和力的方法

权利要求书

1.一种推算混合物中候选配体相对亲和力的方法，该方法的特征是以混合物为样品，选用恰当参考配体，经配体竞争结合蛋白上相同活性位点达到平衡，磁力回收蛋白-配体复合物，变性复合物中蛋白并提取所结合配体，色谱分析同步定性鉴定和定量测定参考与候选配体峰面积或峰高，在优化条件下从所得峰面积或峰高推算候选配体的相对亲和力，其实施步骤包括：

(一)、以混合物为样品，选择符合要求的内源性配体为参考配体使样品直接作为测定前样品，或选用符合要求的外源性配体为参考配体，并将适量的外源性参考配体加入样品混合物中得到测定前样品；选用的参考配体有如下特征：

(1)所选参考配体与需测定相对亲和力的候选配体在色谱分析时能被同步定量；

(2)对成分复杂的样品可用不同理化性质参考配体进行多次测定，以便确定不同理化性质候选配体的相对亲和力；

(3)可选用样品中的特定配体为内源性参考配体，此时样品本身为测定前样品；如选用外源性参考配体则需将外源性参考配体加入样品中先混匀作为测定前样品；

(4)测定前样品中所需外源性参考配体量取决于结合反应体系的蛋白量，需保障在所用蛋白量下无候选配体竞争结合时此外源性参考配体结合率仍低于20％；同时需优化测定前样品用量以保障来自测定前样品的各配体结合率都低于20％；如用内源性配体为参考，则来自测定前样品的各配体结合率也需都低于20％；

(二)在恒温的缓冲体系加入适量的相应蛋白和适量的测定前样品，混匀后启动测定前样品中各配体对蛋白上相同活性位点的竞争结合直到达到平衡；

(三)经磁力物理分离回收蛋白与配体复合物，洗涤去除非特异性结合的物质；

(四)变性复合物中蛋白以提取所结合配体，措施包括加热变性蛋白后用有机溶剂或缓冲液提取所结合配体、直接用有机溶剂提取所结合配体、用有机溶剂加热变性蛋白并提取所结合配体；将所得结合配体适当浓缩；

(五)用完全相同色谱系统，分别分析测定前样品和磁分离后提取的所结合配体混合物，同步定性鉴定和定量测定各配体色谱峰面积或峰高；对所用色谱系统要求如下：

(1)对测定前样品和所提取结合配体混合物，所用色谱分析条件必须完全相同；

(2)据需测定亲和力配体的性质选择和优化色谱系统以保障分辩率和灵敏度；

(3)在配体混合物组成足够简单时可用高效液相色谱结合紫外吸收检测分析； 

(4)在候选与参考配体都有良好挥发性时可用气相色谱进行分析；

(5)可保障灵敏度和分辩率的毛细管电泳色谱分析系统也可用；

(6)对组成复杂样品用质谱检测器；

(六)优化步骤(一)中加入的参考配体量、步骤(二)中加入的相应蛋白量和测定前样品量以及步骤(四)中所得结合配体在色谱分析前的稀释或浓缩比例；在满足所有条件后，可据测定前样品中各配体色谱峰面积或峰高、磁分离后所得各结合配体色谱峰面积或峰高、各配体回收率，用如下的近似公式计算候选配体相对亲和力；设定下列符号以推导用色谱定量指标计算相对亲和力的近似公式：

A_TB：测定前样品加入竞争结合体系后参考配体定量指标，用色谱峰面积为代表；

A_TX：测定前样品加入竞争结合体系后候选配体X定量指标，用峰面积为代表；

A_BB：结合配体混合物中参考配体定量指标；     RR_B：参考配体的回收率；

A_BX：结合配体混合物中候选配体X定量指标；    RR_X：候选配体X的回收率；

I_B：参考配体色谱定量线性响应曲线的截距；    K_B：参考配体的解离常数；

I_X：候选配体色谱定量线性响应曲线的截距；    K_X：候选配体X的解离常数；

P_f：达到平衡后竞争结合反应体系未被结合的蛋白位点浓度；

N：提取的结合配体混合物相对于竞争反应体系的浓缩比例；

在液相体系结合反应体系达到平衡后所生成的蛋白与任一配体的复合物量应符合质量作用定律，故对参考配体和任一候选配体X下述两个关系式可成立：

因候选配体与参考配体竞争结合相同位点，则上述两个关系式中的游离未结合位点浓度，即P_f，为同一个物理量，故候选配体与参考配体的相对亲和力可表示如下：

各配体色谱定量指标都高于其线性响应曲线截距5倍，则相对亲和力可近似为：

各配体结合率都低于20％，则相对亲和力可进一步近似如下： 

计算相对亲和力只需相对定量指标；如参考配体亲和力已知，则此方法可测定候选配体解离常数；当比较不同混合物样品中不同配体的亲和力时，如用相同参考配体则其亲和力可未知，如用不同参考配体则需已知它们的相对亲和力。